徐隋意,李光来

间充质干细胞(MSCs)是一群来源于中胚层的具有多向分化潜能的非造血系成体干细胞,因此又被称为多能干细胞[1]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)对组织损伤小不触及伦理道德问题等优点,已成为间充质干细胞最主要的来源[2]。由于BMSCs可诱导分化成如胆碱能[2]、多巴胺能[3,4]等不同递质的神经元,BMSCs在治疗神经内科各种疾病如Alzheimer病、Parkinson病等有着不可比拟的优势。因此本实验旨在初探GSP对BMSCs诱导分化后神经元样细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 骨髓取材于山西医科大学动物实验中心,Wistar大鼠股骨,LG-DM EM(Hyclone)、兔抗鼠MAP-2(博奥森)、羊抗兔二抗(博士德)、即用型SABC试剂盒(博士德)、4%多聚甲醛、PBS、3%H2O2、倒置显微镜、5%CO2培养箱、超洁净工作台、酶标仪、流式细胞仪等。

1.2 BMSCs的分离及体外扩增 取成年健康雄性Wistar大鼠,用PBS反复冲洗去除股骨表面酒精。一次性注射器抽取含有10%FBS及100 U/mL青霉素、链霉素双抗的 LG-DMEM 5mL,反复冲洗髓腔内容物至培养瓶中。放入37℃、5%CO2培养箱中常规培养72 h,使BMSCs充分贴壁。首次半量换液,以后每3 d～4 d根据细胞代谢状况全量换液。待BMSCs在显微镜下铺满瓶底 90%左右传代:弃上清,PBS冲洗3遍,加入0.25%胰酶1 mL,同时镜下观察。用无菌滴管吹打细胞100次～200次,制成单细胞悬液。

1.3 GSP干预 取第5代BMSCs分为 4组:空白对照组,GSP低浓度组、GSP中浓度组、GSP高浓度组。将培养瓶中上清吸弃,PBS冲洗3遍。空白对照组加入LG-DMEM 5mL,低中高浓度组分别加入含有GSP 20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L的LG-DMEM 5mL,培养箱孵育24 h。

1.4 BMSCs向神经元样细胞诱导分化[5]将4组培养瓶中上清吸弃,PBS冲洗3遍。加入含有20%胎牛血清的1 mmol/L BME预诱导24 h,再弃上清,PBS冲洗。加入含有40 ng/mL bFGF的无血清培养基作为诱导液诱导24 h。……