黄 敏,陈显久,王 彦,杨 静

脂联素是近年来发现由脂肪细胞分泌的一种蛋白质,其具有增加胰岛素敏感性[1]、抗动脉粥样硬化[2]、抗炎症[3]、防治肝纤维化[4]、抑制肿瘤生长[5]和影响骨代谢[6]等重要生物学作用。脂联素蛋白全长247个氨基酸,包含有N端信号序列、可变区、胶原样区和 C端球状结构域(globular adiponectin,gAd)4个功能性结构域[7]。关于gAd的研究证实其具有抗糖尿病[8]、促进游离脂肪酸氧化[9]和抗动脉粥样硬化[10]等生理学作用,因此其生物制剂在治疗2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)等方面有着良好的应用前景。本研究利用基因工程技术建立gAd的真核表达载体pcDNA3.0-gAd,为进一步研究gAd的生物学活性,探讨其在T2DM治疗中的作用效果奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒和菌株 真核表达载体pcDNA3.0由解放军军事科学院生物化学教研室保存提供。菌株E.coli JM109由山西医科大学生物化学教研室提供。

1.1.2 主要试剂和酶 基因组 DNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker,λ-Hind Ⅲ DNA digest,Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶EcoR I、Xho I,DNA凝胶回收试剂盒,DNA片段连接试剂盒,PCR片段纯化试剂盒,质粒提取试剂盒均购自Takara公司。

1.1.3 设计和合成引物 根据基因库中报道的脂联素的基因序列(GenBank:EU420013.1),用DNAman软件设计扩增 gAd引物引物合成和序列测定由Takara公司完成。

1.2 方法

1.2.1 健康人全血基因组DNA的提取 健康人全血 由山西医科大学第一医院内分泌科提供。取健康人全血 200 μ L,使用基因组 DNA提取试剂盒,获取约 1 μ g的基因组 DNA,取1 μ L进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.2 利用PCR扩增gAd基因片段 gAd引物由宝生物公司合成并纯化。

1.2.3 目的片段回收、双酶切和纯化 使用DNA凝胶回收试……