田永青,李东芳,李光来,解学军,冀俊林

CD40与CD40L结合后可诱导基质金属蛋白酶-3(MMP-3)等的表达[1]。然而MMP-3可降解细胞外基质,改变血管通透性,参与血管源性脑水肿。本实验通过分析大鼠脑缺血再灌注后脑组织CD40L、MMP-3、神经功能评分与脑含水量的变化特点,进一步探讨CD40L、M MP-3参与脑缺血再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂及设备 雄性Wistar大鼠48只,体重250 g～350 g,购于山西医科大学生理实验室。将其分为假手术组(sham)、缺血再灌注组(IR组,分为 6 h、24 h、48 h、72 h、7 d亚组)。CD40L、MM P-3抗体:北京博奥森生物技术有限公司;SABC染色试剂盒、DAB显示试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司。BI-2000医学图像分析系统软件(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 动物模型制作方法 参照Zealonga的改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓死模型(MCAO)。基本步骤:大鼠于术前夜禁食;称重后,用10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔麻醉;备皮,消毒并于颈部行25 mm纵向切口,分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA);结扎ECA与CCA;于ECA与 ICA分叉下方剪一切口,将一预先处理过的渔线插入CCA,经ICA入颅直到有轻微阻力感为止,插入深度为(20.0±0.5)mm,实现大脑中动脉阻塞。结扎入口处,渔线外留1 cm,消毒,全层缝合伤口。2 h后提拉线头至CCA,实现对缺血脑组织再灌注,造模完成。

1.3 取材和指标的检测 大鼠脑再灌注后,用10%水合氯醛麻醉,开胸暴露心脏,经升主动脉插管剪开左心耳,用生理盐水250 mL快速冲洗,取脑,切右侧半脑在4%多聚甲醛中固定6 h。用免疫组化检测脑组织CD40L、MMP-3。每只大鼠各个指标做一张切片,每张随机取5个视野,计算CD40L、MMP-3的阳性细胞数并进行光密度值测定。取平均值作为统计参数。

1.4 神经功能评分 用Longa神经功能评分法评分。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻微神经功能缺损,不能完全伸展左侧前爪;2分:中度局灶性神经功能缺损,向左侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损,向左侧倾倒;4分:不能自发行走或意识丧失。1分～3分为有效模型。

1.5 脑组织含水量测定 用干湿重法。取脑后在电子天平上称得其湿重,然后取左侧半脑即刻置于烤箱,100℃恒温烘烤24 h至恒重,称干重并计算含水量。脑含水量=(湿重-干重×2)/湿重×100%。

2 结 果

2.1 再灌注后CD4OL的表达 再灌注6 h已有CD40L的表达,24 h、48 h阳性细胞数和光密度值达到高峰,72 h后开始降低,7 d仍有表达,达到一比较稳定低值。详见表1。

表1 各组大鼠脑组织CD40L表达(±s)

表1 各组大鼠脑组织CD40L表达(±s)

组别 n 阳性细胞数(个/切片)光密度值sham组 8 0 0 IR组 6 h 8 7.13±2.701) 0.223±0.0091)24 h 8 21.25±7.131)2) 0.310±0.0121)2)48 h 8 28.25±8.081)2)3) 0.383±0.0161)2)3)72 h 8 18.63±4.751)4) 0.345±0.0171)4)7 d 8 5.13±2.234)5) 0.213±0.0134)5)与sham组比较,1)P＜0.01;与6 h组比较,2)P＜0.01;与24 h组比较,3)P＜0.05;与 48 h组比较,4)P＜0.05;与 72 h组比较,5)P＜0.01

2.2 再灌注后MM P-3的表达 再灌注6 h已有M MP-3的表达,24 h,48 h阳性细胞数与光密度值达到高峰。详见表2。

表2 各组大鼠脑组织MMP-3表达(±s)

表2 各组大鼠脑组织MMP-3表达(±s)

组别 n 阳性细胞数(个/切片)光密度值sham组 8 0 0 IR组 6 h 8 5.88±2.231) 0.236±0.0091)24 h 8 19.25±7.381)2) 0.356±0.0111)2)48 h 8 24.88±6.561)2)3) 0.482±0.0151)2)3)72 h 8 16.59±5.271)4) 0.423±0.0081)4)7 d 8 4.88±2.104)5) 0.230±0.0104)5)与sham组比较,1)P＜0.01;与6 h组比较,2)P＜0.01;与24 h组比较,3)P＜0.05;与 48 h组比较,4)P＜0.05;与 72 h组比较,5)P＜0.01

2.3 再灌注后神经功能评分(见表3)

表3 各组大鼠再灌注不同时间点Longa评分(±s)

表3 各组大鼠再灌注不同时间点Longa评分(±s)

组别 n 神经功能评分秩次sham组 8 5.38±3.89 IR组 6 h 8 22.50±8.021)24 h 8 34.63±10.211)2)48 h 8 38.13±6.731)2)3)72 h 8 27.63±11.761)4)7 d 8 18.75±6.944)5)与sham组比较,1)P＜0.01;与6 h组比较,2)P＜0.01;与24 h组比较,3)P＜0.05;与 48 h组比较,4)P＜0.05;与 72 h组比较,5)P＜0.01

2.4 再灌注后脑含水量(见表4)

表4 各组大鼠再灌注后脑含水量(±s)

表4 各组大鼠再灌注后脑含水量(±s)

组别 n 脑含水量(%)sham组 8 75.63±1.20 IR组 6 h 8 78.11±1.221)24 h 8 80.73±1.191)2)48 h 8 82.39±1.071)2)3)72 h 8 79.24±1.341)4)7 d 8 77.06±1.174)5)与sham组比较,1)P＜0.01;与6 h组比较,2)P＜0.01;与24 h组比较,3)P＜0.05;与48 h组比较,4)P＜0.05;与 72 h组比较,5)P＜0.01

3 讨 论

CD40属于 TNF-γ受体家族,主要表达于单核细胞、内皮细胞和小胶质细胞也能表达[2]。CD40L是TNF超家族成员,主要表达于活化的CD4+T细胞,巨噬细胞、小胶质细胞也能表达[3]。目前CD40/CD40L参与脑缺血再灌注损伤的研究大多源自动物实验。Ishikawa等[3]发现敲除CD40或CD40L基因的小鼠MCAO模型,其大脑的梗死体积较对照组减少30%～40%,表明在脑缺血再灌注损伤过程中CD40/CD40L信号系统起重要作用。近年来研究的有关卒中患者的CD40L主要是血清sCD40L,其中95%由血小板分泌而非来自脑组织,且血清sCD40L在体外不能诱导内皮细胞炎症反应,而重组的sCD40L却能;可知sCD40L在脑缺血病理生理过程中的作用并不肯定。MM P-3为锌离子依赖性内肽酶,已证实MMP-3单倍体可以预测脑卒中[4],而最近研究发现MM P-3和MMP-9可能会导致血管源性脑水肿[5]。显然以上研究的CD40L和MMP-3都来源于血清且作用机制并不十分明确,而脑组织中的CD40L和MM P-3目前还研究尚少。

本实验中发现缺血再灌注6 h后脑组织有CD40L与MMP-3的表达,24h～48h阳性细胞数与CD 40L和MMP-3的表达强度均达高峰,72 h后开始下降,7 d仍有较低表达,与脑含水量、神经功能评分变化特点基本一致。证实脑组织中CD40L、MM P-3与脑缺血再灌注损伤密切相关,可能为以下机制:缺血再灌注后脑组织CD40L表达增高,诱导M MP-3分泌,MM P-3可以通过降解各型蛋白及胶原来参与血脑屏障的损伤;MM P-3还可激活MM P-9,共同参与血脑屏障的损伤。白细胞通过受损的血脑屏障渗入脑组织,并分泌相关炎性介质促进炎症,加重脑水肿,造成缺血脑组织的损伤。然而CD40L的作用并不局限于此,其信号通路可以通过诱导细胞因子、黏附分子、趋化因子等参与脑缺血再灌注损伤。

综合分析CD40L在脑缺血再灌注损伤的炎症级联反应中处在上游,如果能及时有效的阻断CD40/CD40L通路,将能极大减少再灌注损伤。如何能找到特效的通路阻滞剂仍是今后研究的重点。

[1]Mach F,Schonbeck U,Fabunmi RP,et al.T lymphocytes induce endothelial cell matrix metalloproteinase expression by a CD40L dependent mechanism implications for tubule formation[J].Am J Pathol,1999,154:229-238.

[2]Geldart T,Illidge T.Anti-CD40 monoclonal antibody[J].Leuk Ly mphoma,2005,46:1105-1113.

[3]Ishikawa M,Vowinkel T,Stokes KY,et al.CD40/CD40 ligand signaling in mouse cerebral microvasculature after focal ischemia/reperfusion[J].Circulation,2005,111:1690-1696.

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[5]杨虹,魏桂荣,李红戈.脑梗死血清 MMP-3与M MP-9的动态变化及临床意义[J].中国康复,2005,20(5):278-280.