梁静涛 谢 利 田嵘榛 刘福友 成都中医药大学中西医结合 2007级博士研究生(成都 610075）

缺血性脑卒中气虚血瘀证动物模型的研究展望

梁静涛 谢 利 田嵘榛 刘福友△成都中医药大学中西医结合 2007级博士研究生(成都 610075）

气虚血瘀证是缺血性脑卒中临床最常见的几种中医证型之一,多是由于年老体衰、劳累过度或先后天精气不足等病因引起,再因“气虚则血行无力而瘀滞”,最终导致人体内血行不畅、壅阻血脉、停积为瘀的证候。近年来,随着中医证候学逐渐成为中医学研究的特色和重点以及中医药研发的理论需要,许多相应的中医证侯动物模型也应运而生,并在证侯模型的基础上建立了许多中医疾病的证侯模型,其中缺血性卒中气虚血瘀证动物模型便是研究较深入的领域之一。

1气虚血瘀证证候动物模型的建立现有的中医证候动物模型制作方法主要有病因模拟、症状模拟和病理生理模拟三种。病因模拟是从导致“证候”发生的常见致病因素入手,采用物理、化学等方法,按此证侯的发病因素进行模拟,使之从病因上符合传统中医药理论与思维方式;症状模拟以模拟“证候”的典型症状、体征为重点,采用物理、化学、手术等方法,模拟证侯的临床表现,故其评价应从“证候”的临床辨证标准着眼,使之真正具有证候的特征与代表性[1]。病理生理模拟则是着眼于现代医学对中医证侯研究的理论基础,采用化学、手术等方法,模拟西医学中与中医证侯相似的某种病理生理状态,使其符合现代中西医的病理生理研究理论。

目前,气虚血瘀证动物模型的制作主要还是采用病因模拟的方法为主,结合症状模拟的思路,对病因模拟的动物模型进行症状体征评价,最终确定模型成功与否。而至今为止,还没有依据单纯症状模拟所建立的气虚血瘀证动物模型,主要是由于目前尚没有各模型间对证侯统一的观测指标及评价标准造成的。对于单纯病理生理模拟的证侯模型,由于观测指标的宽泛性及现代医学的病理生理状态是否与中医证侯具有等同性等问题,一部分模型还存在争议,因此缺血性脑卒中的中医证侯动物模型中也较少使用。

现今常用的缺血性脑卒中的气虚血瘀证侯的动物模型主要有以下几种[2]:“单纯游泳”模拟气虚血瘀证模型根据“劳则耗气”的中医理论,采用过度运动疲劳的方法,日久耗气而致气虚,“气虚则血行无力而瘀滞”。故采用游泳的方法可制备气虚证模型大鼠[3],并且此过程中观察到模型大鼠血液流变学异常,故有人将此法用于制备气虚血瘀证模型[4,5]。有关气虚血瘀证研究认为,模型动物血流变、血小板等血瘀证相关指标均达到血瘀证诊断标准[6]。

“游泳+饥饿+中年”模拟气虚血瘀证模型“年四十,而阴气自半”,中年是机体衰老过程的重要阶段,强迫游泳可导致大鼠气虚,并且气主要依赖于水谷精微滋养,《灵枢◦五味篇》:“谷不入,半日则气衰,一日则气少矣”。故选取中年大鼠,配合游泳和饥饿制备气虚血瘀证模型,研究发现模型大鼠耐疲劳时间缩短,细胞免疫功能显著降低,血液流变性呈低黏状态改变,认为中年大鼠气虚血瘀证动物模型成立,并且认为这种模型对中年保健及抗衰老研究有重大的意义[7]。

“游泳+饥饿+中年+高脂饮食”模拟气虚血瘀证模型[8]主要根据中医“饥则损气”、“劳则耗气”及“甘肥贵人,则高粱之疾”的理论,采用饥饿、劳累、高脂饮食诱导中年大鼠的气虚血瘀证模型,并对所建立的气虚血瘀证模型制定了较详细的量表评价法进行评价。是目前比较完善的从病因、症状、治疗及相关指标上进行研究的证候动物模型之一。

2病症结合的缺血性脑卒中气虚血瘀证动物模型的建立目前,缺血性脑卒中模型的造模方法较多,如线栓法、电凝法等。其中依据 ZeaLonga方法[9]制作局灶性脑缺血再灌注的 MCAO模型是最为常用的一种,不但能够获得稳定的梗死灶,且可以进行再灌注损伤的研究,是目前公认的能够观察再灌注损伤的动物模型。本方法的优点是梗死范围稳定,重复性好。操作较简便,手术时间短,不需开颅,对动物全身的生理功能影响小,且缺血和再灌注时间可准确控制,是研究局灶性脑缺血再灌注损伤的较好动物模型。

在前述中医气虚血瘀证模型的基础上,再根据西医理论复制缺血性脑卒中的疾病模型,把两者结合起来,便形成了病证结合的中医疾病证侯的动物模型。然而,可以看出,这种病证结合的中医动物模型与实际的临床中医疾病证侯仍然有着明显的差别。最主要的便是其缺乏中医自然发病的延续性,其中的疾病过程是采用人为的方法触发,并且由于是将中西医两种模型结合在一起,所以它们之间可能互相影响,互相掩盖,很难达到病证结合的理想状态。一般而言,成功的模型建立必须满足三个条件:①模型与原型之间有相似关系。②模型能够代替原型。③对模型的研究,应该能够得出原型的信息。就中医证候动物模型而言,所谓原型就是指中医证候以及具有中医特色病证结合的病理反应[10]。但就目前的技术水平及手段来看,理想的自然发病缺血性脑卒中病证结合模型仍无法完全达到。

3该领域内存在和亟待解决的问题我们可以看到,目前大多数中医证侯的动物模型尚不能达到完全的“病证结合”。现有的病证结合动物模型多是根据西医理论复制疾病模型,根据中医理论复制证候模型,再把两者结合起来。多数模型是在西医疾病模型的基础上利用人为干预手段或施加因素如用西药处理,采用物理、化学等方法使动物生活环境、条件改变(如进食量、温度、运动等）造成同时具备相应证候的模型[5]。因此这与临床自然发生的疾病证候是有明显差别的,最重要的便是,其缺乏中医证候及疾病自然发生的延续性。如缺血性脑卒中气虚血瘀证模型的建立,目前主要采用将健康大鼠在劳累、高脂饮食等外界因素的诱导下,产生气虚血瘀证候,在此基础上,模拟线栓、开颅电凝等缺血性脑卒中模型,最终获得病证结合的动物模型[8]。显而易见,目前采用的此类方法缺乏中医证候和疾病发生之间的必然性,并且由于 MCAO等模型更类似于栓塞模型,故该证候模型体现的机体状态更趋向于气虚血瘀状态合并血管栓塞形成后所导致的病理生理状态,这与临床上气虚血瘀证由气虚到血瘀,最终形成卒中前状态而发生卒中的过程还有很大的差异。因此,此类模型用于研究实际的缺血性脑卒中,特别是结合中医证候的病证结合模型研究,还有许多不足。因此,我们思考要将疾病及证候的要素更和谐自然地体现在一种病证结合的模型上,就需要满足以下两个关键点:①动物本身便具有形成某种证候的倾向;②动物本身也具备患某种疾病的倾向,或者说具备形成发生此种疾病所对应病理生理状态的潜在趋势。

满足了这两个关键点的动物模型,便能以更自然的方式诱导证候和疾病的产生,并能以更和谐的方式在机体功能、病理变化上达到证候与疾病的进一步统一。

目前的研究已经证实,遗传与缺血性脑血管病有关。 2002年,Gretarsdottir等[11]报道的冰岛人群卒中基因的研究就明确地发现,5q12中 D5S2080区段与卒中存在肯定的连锁关系。此后的大量研究也证明缺血性脑血管病确实是遗传因素和环境因素共同作用引起的一种临床综合征[12]。其与遗传因素的关系在中间表型的研究中亦得到了证实[13]。除部分脑卒中为单基因遗传病(如 CADASIL脑病、线粒体肌病 Melas型等）,符合 Mendel遗传规律外,绝大多数常见的卒中应该是多基因因素作用的结果。其起作用的往往是许多影响力较小的等位基因,靠其整体效能与环境因素相互作用而诱导疾病的产生。目前认为高血压、高脂血症、糖尿病等作为脑血管病危险因素,其发生同样有遗传因素参与,另有一些基因直接参与了脑血管病的形成,这样在脑血管病的每一步病理过程中都可能存在遗传的影响,相关动物试验亦证实了这一观点[14]。

目前对动物实验、单基因综合征的遗传分析,以及遗传同质种群的应用已经有了重大突破。对 SHRSP动物模型的研究真实地反映了人类缺血性脑血管疾病的遗传特质。特别是通过在两个不同的 F2杂交群体中使用遗传连锁的方法,已经获得了 SHRSP中风基因存在的证据:一个来源于 SHRSP和自发性高血压抗中风大鼠的(SHRSR）交配[15];第二个来源于SHRSP和 WistarKyoto大鼠异系杂交[16]。这两项研究证明了大鼠对脑梗死的易感性具有遗传性,确定了对染色体数量性状遗传位点的识别——含有对表型直接作用的基因。因此,该动物模型中的中风风险表明了复杂的基因和基因以及基因和环境之间相互作用的平衡。目前已发现与缺血性脑血管病相关的易感基因主要有[17]:(1）肾素血管紧张素系统相关基因;(2）内皮型一氧化氮合酶基因;(3）脂代谢相关基因;(4）凝血 /纤溶相关基因;(5）半胱氨酸代谢相关基因;(6）其他相关基因,这些遗传因素可能通过影响诸如高血压等危险因素诱发卒中,但也可能直接诱发卒中[18]。

另一方面,对基因突变的研究也认为,多个基因突变的共同作用可能是病因不明性动脉卒中的病因,至少构成了叠加的病理因素[19]。如血栓形成倾向多数是遗传性的,也可以是后天获得性的,或者两者同时存在,其始动因素可能是父代因环境因素影响,获得此种突变,遗传所致[20]。另有研究也表明,采用外界因素(如冷刺激、高盐饮食等）诱导大鼠脑卒中的发生,发现大鼠某些基因发生差异性的改变[21]。

综合目前的研究结果,我们可以看到父代在一定外界因素或缺血性脑血管病危险因素的干预影响下,自身能够产生某种变化(可能是基因水平的,亦可能仅仅是基因表型的改变）,而此种变化有可能导致子代较之正常个体更具缺血性脑血管病的易感性。因此,我们提出假设:是否能通过遗传的方式建立更具缺血性脑卒中易感性,更易诱导其发生缺血性脑卒中前病理生理状态的动物模型?同时,是否能在此基础上,对于父代动物采取干预手段,使其子代具有中医“先天精气不足”的特性?

如果此种假设成立,则此种子代模型可能因其具有缺血性脑卒中的易感性,更易在外界干预因素的作用下,诱导更为自然的缺血性脑卒中前的病理生理状态。也因此,其较之以往的此类模型,便更接近于临床实际缺血性脑卒中的发病机理和过程。同时,具有“先天精气不足”特性的子代动物,从中医理论来看,更易诱导气虚证候的产生,更适合此类疾病证候的研究。

当然此种模型思路仍然存在许多需要解决的问题。如:1.施加的外界因素对于父代动物的影响是否能引起该动物产生机体的差异性改变(基因表型或者基因水平）;2.此种差异特性是否能够通过遗传的方式传递给子代;3.该种子代是否都能具备这种易感特性,若不是,模型的重复性高低便成为研究的前提和关键,反之,则模型的稳定性便会是该模型后续研究的重点;4.是否可以通过干预手段作用于父代,获得具有“先天精气不足”特性的子代动物。以上均是该模型思路研究的关键。我们提出此种假设,也正是希望能通过对于此类模型动物遗传方面的研究,找到一种更接近于临床自然发病形式,更能反映发病后实际病理生理状态的缺血性脑卒中中医证候模型,并为研究脑卒中相关证候模型或研究与遗传有关其他疾病的病证结合动物模型拓展新的研究思路,进一步推动相关领域的中医药现代化研究的发展。

[1] 王 键,赵 辉,李 净,等.多因素复合制作气虚血瘀证脑缺血动物模型的实验研究[J].中国实验动物学报,2001,(42）:216-220.

[2] 尹军祥,田金洲 ,宋崇顺,时 晶,等.气虚血瘀证动物模型制作方法与评价 [J].中华中医药杂志,2006,21(7）:424-426.

[3] 宋崇顺,廖家桢.气虚证血液流变学的临床观察和实验研究.中医杂志,1981,22(10）:39-41.

[4] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社,1991:146.

[5] 娄金丽,张允岭,郑 宏,等.气虚血瘀证动物模型研究的思路与方法 [J].北京中医药大学学报,2006,29(2）:87-90.

[6] 中国中西医结合研究会活血化瘀专业委员会.血瘀证诊断标准[J].中国中西医结合杂志,1987,3(7）:129.

[7] 庞树玲,高金亮.中年大鼠气虚血瘀证的模拟及其机制探讨[J].天津中医学院学报,1997,16(3）:28-31.

[8] 王 键,胡建鹏.缺血性中风气虚血瘀证动物模型的初步研究[J].安徽中医学院学报,1999,18(2）:46-49.

[9] EZLonga,PRW einstein,SCarlson,et al.Reversible middle cerebra lartery occlusion with out craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-91.

[10] 郭移海,黄 韧,连至诚,等.中医实验动物学 [M].广州:暨南大学出版社,1999.154.

[11] Gretarsdottk S,Svehab jomsdottk S,Jonsson HE et a1.Localization of a suscep tibility gene for common form s of stroke to 5al2 Am JHum Genet.2002.70:593-603.

[12] 张 成.基因多态性与缺血性脑血管病 [J].实用医院临床杂志,2008,5(2）:30-32.

[13] 凌 锋,刘承基,等.脑血管病理论与实践 2007[M].北京:人民卫生出版社 ,2007:31.

[14] Hassna,Markus H S.Genetics and ischemic stroke [J].Brain,2000.123:1784-1812.

[15] Rubattu S, Volpe M, Kreutz R, et al.Chromosoma lm apping of quantitative trait loci contributing to stroke inaratmodelof com-plex human disease[J].NatGenet,1996,13:429-434.

[16] JeffsB,Clark JS,AndersonNH,et al.Sensitivity to cerebral ischaem ic insult in a rat model of stroke is determ ined by a single genetic locus[J].NatGenet,1997,16: 364-367.

[17] Rasteny te D,Tcomileh to J,Ssrti C,Genetics of stroke-a review[J].Jof Neurol Sci,1998,153:132-145.

[18] 梁颖茵,陈松林 ,张 成.脑血管病的遗传学 [J].Cerebrovasc Dis Foreign Med Sci,2004,l2.(6):466-469.

[19] Szo lnokiZ, SomogyvariF, SzolicsM,et al.Common genetic mutations as possible aetiological factors in stroke.EurNeurol,2001,145:119-120.

[20]GreenD.Thrombophilia and stroke.Top Stroke Rehabil,2003,1021-33.

[21] 王先梅,严 睿,杨丽霞,等.复合环境因素诱导大鼠脑卒中机体防御基因表达的改变及意义[J].中华医学遗传学杂志,2003,(20）:143-146.

R-332

A

1000-7369(2010）03-0337-03

△成都中医药大学临床医学院(成都 610075）

(收稿 2009-09-28;修回 2009-11-02）

◦临床报道◦