王景锋，邵军军，李菁，高闪电，独军政，丛国正，林彤，常惠芸

中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 国家口蹄疫参考实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室，兰州 730046

口蹄疫 (Foot-and-Mouth Disease，FMD) 是由口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性并可远距传播的动物疫病。FMDV宿主广泛，口蹄疫发生后由于造成动物生产能力下降，发病地区畜产品上市和出口受限以及为扑灭和控制疫情所用的巨额开支常给地区和国家造成严重的经济损失。人们在与FMD长期的斗争过程中已经充分认识到，应用疫苗进行免疫接种是预防、控制乃至消灭 FMD的有效手段之一。常规的弱毒疫苗与灭活疫苗由于其良好的免疫原性和提供的较高保护力，从而在过去和当前FMD防控中发挥了重大作用。但是这些传统疫苗都存在多种缺点，如安全性不足、需要严格地冷链运输及给区别自然感染动物与免疫动物带来很大困难等。为克服传统疫苗的缺点，利用基因工程技术研制生物安全、优质高效、价廉的新型疫苗已经迫在眉睫，而且成为FMDV相关研究的一个热点领域，也是以后疫苗发展的必然趋势[1]。

本研究拟在克隆Asia I型FMDV结构蛋白VP1基因并对其序列进行测定和分析的基础上，设计和化学合成FMDV抗原表位基因，将其与绵羊免疫球蛋白IgG重链恒定区编码基因串联后在大肠杆菌中进行融合表达，从而获得由羊免疫球蛋白IgG重链恒定区作为载体蛋白携带FMDV抗原表位的多肽抗原，对该融合蛋白的生物学活性进行鉴定后，检测其诱发豚鼠产生免疫应答的情况。以期为进一步研制羊的FMDV表位肽疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、菌株及主要试剂

Asia I Jiangsu/China/2005 FMDV由国家口蹄疫参考实验室保存，BHK-21细胞、大肠杆菌JM109、BL21 (DE3) 及原核表达载体pPROEx HTb由本室保存，pGEM T-easy克隆载体购自Promega公司。限制性核酸内切酶、RT-PCR反应试剂盒 (TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0)、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、低分子量蛋白质分子量标准Marker、质粒提取试剂盒、DNA 片段纯化试剂盒均购自宝生物工程 (大连) 有限公司，RNA 提取试剂盒(RNeasy Mini Kit(50)) 购自Qiagen公司，蛋白纯化试剂盒购自 Novagen 公司。细胞培养用胎牛血清和DMEM/High Glucose培养基购自Hyclone公司，兔抗绵羊IgG抗体及DAB显色试剂购自博士德生物工程有限公司，其他试剂均购自Sigma公司。

1.2 羊IgG重链恒定区基因的克隆及FMDV抗原表位编码基因的合成

按照Qiagen公司RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit(50) 使用说明从绵羊脾脏组织提取总mRNA后，进行 RT-PCR反应。首先按照 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0使用说明在PCR管中组成反应体系和设置反应条件进行反转录反应，然后以反转录得到的 cDNA为模板，用特异性引物：shIgG(C)-upper:5′-CTGCCTCAACAACACCCCCGAAA-3′；shIgG(C)-lower:5′-ATTTACCCGGAGGCTTAGAGA TCGAC-3′进行PCR扩增目的基因。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min 进行预变性；然后94 ℃ 1 min，58℃40 s，72 ℃ 1.5 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。通过 RT-PCR扩增得到目的基因并将其重组于pGEM T-easy克隆载体，对所得重组体进行酶切和PCR鉴定，阳性质粒命名为pGEM-shIgG(C)，送上海生物工程公司进行测序鉴定。

用与上述基本相同的方法，从 AsiaⅠ Jiangsu/ China/2005 FMDV细胞适应病毒中提取病毒基因组RNA，应用引物 VP31:5′-CACAAATGTACAGGG ATGGGT-3′和NK61:5′-GACATGTCCTCCTGCATCT G-3′，在56℃退火条件下，通过RT-PCR扩增得到FMDV VP1基因并将其重组于pGEM T-easy克隆载体，对所得重组体进行酶切和PCR鉴定，阳性质粒命名为pGEM-VP1(JS)，送上海生物工程公司进行测序鉴定。对测定结果进行全面分析后，选择病毒主要抗原表位基因所在区段设计出Asia ⅠF MDV 抗原表位编码基因并送往大连宝生物工程有限公司进行人工合成。表位基因重组于pMD19-T simple载体，并命名为pMD-F。

1.3 重组表达质粒的构建

以质粒 pGEM-shIgG(C) 为模板，应用引物P1-EcoR I:5′-GGGAATTC GCCTCAACAACACCCC CGAAA-3′和P2-Xho I:5′-GGGCTCGAGTTTACCCG GAGGCTTAGAGATCGAC-3′通过PCR扩增羊IgG重链恒定区基因，PCR 产物经EcoR I和Xho I酶切后，与经同样酶切过的pPROEx HTb载体相连接，构建成羊 IgG重链恒定区基因的表达重组质粒pPRO-shIgG。对构建正确的 pPRO-shIgG 应用BamH I和EcoR I进一步双酶切，然后与从pMD-F质粒上应用同样酶切得到的表位基因片段相连接，从而构建得到融合表达FMDV抗原表位和羊IgG重链恒定区的重组质粒pPRO-FshIgG (图1)。

图1 表达质粒pPRO-FshIgG的构建Fig. 1 Construction of expression plasmid pPRO-FshIgG.

1.4 蛋白的表达、纯化及鉴定

将鉴定为阳性并且测序确定正确的 pPRO-shIgG和pPRO-FshIgG重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，挑取单克隆并增菌后，将阳性菌在添加氨苄青霉素的 LB液体培养基中培养过夜，然后按1%转接到含0.06 mg/mL氨苄青霉素的 LB培养基中，37℃培养至对数生长期(OD600= 0.6)，加入终浓度1 mmol/L的IPTG，37℃振荡培养，取各时间段 (2 h、3 h、4 h) 的表达产物各1 mL进行SDS-PAGE分析。

在鉴定重组菌能够正确高效表达后，将其进行大量培养并诱导表达蛋白。对表达的蛋白应用镍离子亲和层析技术进行纯化，对纯化产物进行SDS-PAGE分析。由pPRO-shIgG和 pPRO-FshIgG表达的蛋白分别命名为shIgG和FshIgG。然后应用兔抗山羊 IgG抗体及 FMDV标准阳性血清进行Western blotting对shIgG和FshIgG进行鉴定。

1.5 抗原制备与动物免疫

对上述纯化的蛋白进行浓度测定后，用蛋白溶解液调整蛋白液浓度为200 µg/mL。按1:1的体积比加入蛋白液和206油佐剂后用玻璃注射器反复抽吸使之完全乳化而制成免疫抗原，这样每毫升疫苗中最终含有100 µg蛋白。

将体重在250~300 g的24只豚鼠随机分成4组(6只/组)，第一组每只豚鼠于后肢内侧肌肉注射shIgG制备抗原1 mL；第二组豚鼠注射FshIgG制备的抗原 1 mL；第三组豚鼠按推荐剂量注射商品化AsiaⅠF MDV 灭活疫苗 (购自中国农业科学院中农威特公司) 1 mL作为阳性对照；第四组豚鼠注射等量PBS作为阴性对照。第1次免疫后28 d对各组动物进行第2次免疫。所有豚鼠于无FMDV的隔离环境中饲养。

1.6 血清抗体动态监测和中和抗体效价测定

在免疫前、免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d对豚鼠进行心脏采血，分离血清用于抗体测定。将Asia Ⅰ型FMDV灭活抗原用ELISA包被液进行1/8稀释后包被ELISA反应板后，按文献报道的方法应用间接ELISA方法测定血清中抗FMDV抗体[2]。

在96孔细胞培养板上测定并用Karber法计算AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV 对BHK-21细胞的半数组织感染量 (TCID50/100 µL)[3]。通过微量中和试验对动物免疫前、免疫后28 d和免疫后42 d采集血清中的中和抗体效价进行检测。将待检血清 56℃灭活30 min后，用DMEM/High Glucose培养基在96孔细胞培养板中按50 µL进行2倍系列稀释，每个稀释度重复4孔，然后每孔中加入50 µL含有200 TCID50/ 100 µL的病毒液，37℃细胞培养箱中作用1 h后每孔加入50 µL浓度为1×105个/mL的BHK-21细胞悬液，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。48 h后在镜下作初步判断，72 h用4%多聚甲醛固定30 min，用10%福尔马林溶液配制的0.05%亚甲基蓝染液染色30 min后用水冲洗，未病变细胞孔呈蓝色，发生病变而细胞脱落者不着色。试验时设立阳性和阴性血清对照、病毒回归试验对照、血清毒性对照和正常细胞对照。按照Karber法计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的最高血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。

1.7 动物保护性试验

首先测定AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV 豚鼠适应病毒的ID50。取在−70℃、含有50%甘油PBS缓冲液中保存的含病毒豚鼠脚皮0.1 g置于研钵中，加石英砂研磨，用PBS缓冲液(pH 7.4) 制成1∶10 (W/V)的悬液，置于 4℃浸毒过夜。然后 2000 r/min离心10 min取上清，用PBS(pH 7.4) 进行10倍系列稀释，将10−3、10−4、10−5、10−6、10−7稀释度的病毒液0.2 mL于豚鼠左后跖部皮内及皮下接种，每个稀释度接种300~350 g豚鼠4只。每24 h观察记录发病情况，至72 h最终判定并计算半数感染量 (ID50)[2]。

试验豚鼠在第 2次免疫后第 14天用上述测知ID50的AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV豚鼠适应病毒进行攻毒。各组的6只豚鼠左后跖部皮内和皮下接种200倍ID50剂量的病毒液。连续观察72 h，判定豚鼠发病情况。

2 结果

2.1 羊IgG重链恒定区基因的克隆

应用 RT-PCR技术，以从绵羊脾脏中提取的总mRNA为模板扩增到了预期大小的目的DNA片段，在电泳图谱中可见一约 1000 bp左右的特异性条带(图2)。将上述扩增到的DNA片段与克隆载体pGEM T-easy 重组后，对所得重组体应用EcoR I酶切消化鉴定。酶切图谱与预期一致，从重组体上切下了特异的目的基因片段。对酶切鉴定阳性的重组体pGEM-shIgG(C) 进行序列测定，测序结果表明，克隆到的基因大小为993 bp，将其与GenBank中已提交的羊IgG重链恒定区基因序列 (GenBank Accession No. X69797.1) 进行比较发现，克隆到的羊IgG重链恒定区基因序列与该序列的相似性高达99%以上。以上基本说明所克隆羊IgG重链恒定区基因序列的正确性。

以AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV 细胞适应病毒中提取的病毒基因组RNA为模板，应用引物VP31和NK61扩增得到一约800 bp的DNA片段。该DNA重组于pGEM T-easy克隆载体后，对用酶切和PCR方法鉴定为阳性质粒命名为pGEM-VP1(JS) 送上海生物工程公司进行测序鉴定。结果表明，所克隆到的基因完整涵盖了FMDV结构蛋白VP1基因片段，将其与国家口蹄疫参考实验室已公布的该毒株的基因序列 (GenBank Accession No. EF149009.1) 比较发现，两者的相似性为100%。

图2 羊IgG重链恒定区基因的PCR扩增Fig. 2 PCR product of sheep IgG heavy chain constant region gene. M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of sheep IgG heavy chain constant region gene.

图3 FMDV VP1基因的PCR扩增Fig. 3 PCR product of FMDV VP1 gene. M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of FMDV VP1 gene.

2.2 FMDV抗原表位基因的设计、化学合成

根据上述所克隆并测定的 AsiaⅠ Jiangsu/China/ 2005 FMDV株FMDV VP1基因序列，选择VP1的136~160aa及198~211aa位氨基酸肽段，将其应用-G GSSGG-这一短肽连接组成 136~160aa-GGSSGG-198~211aa-GGSSGG-136~160aa-GGSSGG-198~ 211aa重复串联形式 (图4)。对该重复串联肽段的编码基因进行人工化学合成，在其基因的5′端和3′端分别依次引入BamH I和EcoR I酶切位点，并将其与 pMD19-T simple 载体重组，重组体命名为pMD-F。该表位肽编码基因大小为288 bp，共编码96个氨基酸。

图4 Asia I型FMDV抗原表位的设计Fig. 4 Epitope design of type Asia I FMDV.

2.3 蛋白表达、纯化和鉴定

应用 SDS-PAGE检测转化 pPRO-shIgG和pPRO-FshIgG的重组大肠杆菌表达蛋白的情况。电泳图谱显示，重组菌在1 mmol/L的IPTG诱导下分别高效表达了一个40 kDa左右和45 kDa的蛋白，大小与预期目的蛋白大小相符。表达的蛋白应用镍离子亲和层析技术进行了纯化，纯化蛋白的纯度可达80%以上 (图5)。最后对纯化的蛋白应用Western blotting技术进行鉴定，结果发现纯化所得的shIgG蛋白能够和标准兔抗绵羊IgG抗体呈强阳性反应，而FshIgG蛋白则同时能够与兔抗绵羊IgG抗体和豚鼠抗FMDV的标准阳性血清反应 (图6)。

2.4 血清抗体的测定

将所表达的蛋白shIgG和FshIgG乳化制备成疫苗以后免疫豚鼠，应用间接ELISA方法测定血清抗体。结果表明，FshIgG蛋白制成的疫苗免疫的豚鼠在免疫后 7 d就可以检测到特异性抗体，在后续的实验过程中，该组动物的抗体水平一直呈持续增高的趋势。二免后抗体水平有所提高。商品化的灭活疫苗免疫动物在免疫以后则迅速产生抗FMDV的特异性抗体，免疫21 d后就能达到很高的抗体水平，第二次免疫对该组豚鼠抗体水平未见显著影响。作为阴性对照的应用shIgG蛋白和PBS免疫的豚鼠，在整个实验过程中始终检测不到特异性抗体 (图7)。

2.5 血清中和抗体效价的测定

图5 表达蛋白的SDS-PAGE检测Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the expressed protein. 1: induced BL21(DE3) control; 2: induced pPROEx HTb/BL21(DE3) control; 3: protein marker; 4: uninduced pPRO-shIgG/ BL21(DE3) control; 5: induced product of pPRO-shIgG/ BL21(DE3); 6: purified product of shIgG; 7: uninduced pPRO-FshIgG/BL21(DE3) control; 8: induced product of pPRO-FshIgG/BL21(DE3); 9: purified product of FshIgG.

图6 shIgG和FshIgG的Western blotting分析Fig. 6 Western blotting analysis of shIgG and FshIgG protein. 1: shIgG reacted with guinea pig anti-FMDV antibody; 2: shIgG reacted with rabbit anti-sheep IgG antibody; 3: FshIgG reacted with guinea pig anti-FMDV antibody；4: FshIgG reacted with rabbit anti-sheep IgG antibody.

用病毒微量中和试验对各实验组豚鼠在免疫前(0 d)、二免前 (28 d) 及攻毒前 (42 d) 所采集血清中 FMDV的中和抗体效价进行测定。结果显示，FshIgG蛋白免疫豚鼠的血清中能够检测到较高效价的中和抗体。特别是在二免后两周进行攻毒时，其中和抗体效价基本达到了灭活疫苗免疫组动物的抗体水平 (图8)。

2.6 豚鼠攻毒试验

不同稀释度的适应豚鼠的 Asia ⅠJiangsu/China/ 2005 FMDV 液0.2 mL接种豚鼠后，豚鼠的发病情况表明 (表1)，该病毒的ID50应在10−5和10−6之间，按Karber法计算其准确的ID50: lgID50=L−d(s−0.5)，其中，L=最高稀释度的对数；d=稀释度对数之差；s=发病率之和[3]。那么，该病毒的 ID50/0.2 mL为10−5.5。

图7 免疫豚鼠的抗体水平检测Fig. 7 Antibody level of guinea pigs post vaccination.

图8 免疫豚鼠的中和抗体效价检测Fig. 8 Neutralizing antibody titres of guinea pigs.

表1 Asia ⅠJiangsu/China/2005 FMDV ID50的测定Table 1 Identification of ID50 for Asia ⅠJiangsu/China/ 2005 FMDV

用上述测定ID50的Asia I型FMDV对所有免疫豚鼠进行攻击，结果发现用FshIgG免疫的6只豚鼠与用商品化灭活疫苗免疫豚鼠一样，所有豚鼠都未发病，而作为对照组的用PBS和用shIgG免疫的豚鼠则全部发病 (表2)。表明FshIgG蛋白免疫豚鼠后能够给豚鼠提供一定的保护力，使得动物能够抵御FMDV感染。

表2 免疫豚鼠抗病毒能力检测Table 2 Protection of immunized guinea pigs from viral challenge

3 讨论

口蹄疫表位疫苗的研究起步很早，早在 1981年，Kleid等首次在大肠杆菌中成功表达FMDV A12株VP1重组蛋白抗原，并进行了免疫原性的研究分析，结果显示，重组蛋白抗原能够诱导机体产生中和抗体，免疫动物能够抵御同源病毒的攻击，说明VP1蛋白是 FMDV重要的保护性抗原，这为口蹄疫表位疫苗的研制提供了依据[4]。1982年，Bittle等首次报道了用化学合成的 FMDV VP1结构蛋白C端141~160aa短肽，免疫动物后能够诱导机体产生中和抗体，并能抵御同源FMDV的攻击[5]。这一成果成为口蹄疫乃至整个动物疫病表位肽疫苗研究的开端。

过去的大量研究已经表明，O型FMDV结构蛋白VP1上141~160aa和200~213aa是病毒的两个优势中和表位，很多研究都在应用这两个抗原表位进行O型FMDV表位疫苗的研究，并取得了很好的免疫效果[6-8]。因此，本实验选择了Asia I型FMDV结构蛋白VP1上与O型FMDV结构蛋白VP1上141~160aa位和200~213aa相对应的肽段136~160aa和 198~211aa作为抗原表位，将其进行了重复串联后对其基因进行了人工合成。

但是，仅由抗原表位组成的FMDV表位疫苗并不能给动物提供完全保护。究其原因，人们普遍认为由于表位多肽分子量小，易被细胞内的蛋白酶降解，不能够作为良好的免疫原刺激机体产生有效的免疫应答反应，所以为克服表位肽单独存在时免疫原性低的现象，人们常将表位肽与某些蛋白分子偶联来增强其免疫原性。这些蛋白分子常被称为表位载体分子，它们对于免疫动物可以是外源性的，也可以是宿主自身的某些蛋白分子。作为表位载体蛋白的外源性蛋白主要有 BSA[9]、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)[10-11]、霍乱毒素、谷胱甘肽 S转移酶 (GST) 和匙孔血蓝蛋白[12]等。这些外源载体蛋白能够增强表位抗原的免疫原性，延长小分子表位抗原在机体内的降解半衰期。但载体蛋白对机体来说是一种外源抗原，机体会产生针对载体分子的免疫应答反应，可能在一定程度上分散了机体针对疫苗表位的免疫应答能力，从而导致疫苗免疫效果不够理想。国内外学者利用机体免疫系统不对自身物质发生免疫应答这一特点，将口蹄疫病毒VP1蛋白上的若干表位基因串联后与猪免疫球蛋白IgG重链恒定区基因融合，并在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白。利用该蛋白免疫猪后的动物保护性试验显示，多表位重组蛋白疫苗具有较强的免疫原性，其不仅能刺激机体产生高效价的中和抗体，也能有效地诱导机体发生细胞免疫应答，而且免疫猪能够抵御50~100 ID50剂量的同源毒攻击，获得100%保护[13-14]。这在一定程度上显示了动物自身 IgG重链恒定区蛋白作为表位载体蛋白的优越性。

该研究中将上述所设计的表位与绵羊IgG重链恒定区基因串联后在大肠杆菌中得到了成功表达，得到了Asia I型FMDV抗原表位偶联于绵羊IgG重链恒定区蛋白 N端所形成的融合蛋白 FshIgG。将100 µg FshIgG融合蛋白与206油佐剂混合乳化后免疫豚鼠，在免疫后2周应用间接ELISA方法检测到了针对FMDV的特异性抗体。在二免以后2周，用200倍 ID50的病毒剂量对免疫豚鼠进行攻毒试验，结果发现FshIgG免疫组的豚鼠全部得到了保护。这些结果充分地说明FshIgG蛋白具有良好的抗原性，该蛋白不但能够与标准的FMDV阳性血清特异性反应，而且能够在动物机体内诱导产生针对FMDV的特异性的抗体。虽然从 FshIgG免疫组豚鼠血清中FMDV抗体的检测结果来看，抗体水平达不到传统灭活疫苗所诱导的抗体水平，但是却能够提供与灭活疫苗相同的免疫保护。这可能与各自所诱导产生抗体的中和性和亲和力有关系。所以通过病毒微量中和试验对疫苗诱导产生的中和抗体水平进行了测定。结果表明，FshIgG蛋白疫苗2次免疫动物以后，动物血清中的中和抗体效价可达10−2.8，基本与灭活疫苗免疫组豚鼠血清中和抗体水平一致。此外，本实验中之所以应用绵羊IgG重链恒定区蛋白作为抗原表位的载体，构建能够应用于绵羊的FMDV表位疫苗的候选抗原，是因为绵羊在感染FMDV后的发病率相对较低、临床症状不明显，易被忽略，从而携带病毒成为长期的传染源，其素有病原的“贮存器”之说。所以通过疫苗免疫提高羊群整体的FMDV免疫水平显得尤为重要。虽然以绵羊IgG重链恒定区蛋白作为抗原表位的载体的优越性和该抗原在绵羊的免疫效果还需进一步的试验来评价，但本实验的完成为进一步研制绵羊的FMDV表位疫苗奠定了一定的基础。

REFERENCES

[1] Grubman MJ, Baxt B. Foot-and-mouth disease. Clin Microbiol Rev, 2004, 17: 465–493.

[2] Li J. Expression and processing of foot-and-mouth disease virus empty capsid proteins and the assessment of its immunogenicity. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2009.李炯. 口蹄疫病毒空衣壳蛋白的表达加工及其免疫原性研究. 北京: 中国农业科学院, 2009.

[3] Yin Z, Liu JH. Animal Virology. 2nd ed. Beijing: Scienec Press, 1997: 323–354.殷震, 刘景华. 动物病毒学. 2版. 北京: 科学出版社, 1997: 323–354.

[4] Kleid DG, Yansura D, Small B, et al. Cloned viral protein vaccine for foot-and-mouth disease: responses in cattle and swine. Science, 1981, 214(4525): 1125–1129.

[5] Bittle JL, Houghten RA, Alexander H, et al. Protection against foot-and-mouth disease by immunization with chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence. Nature, 1982, 198: 30–33.

[6] Francis MJ, Fry CM, Rowlands DJ, et al. Immunological priming with synthetic peptides of foot-and-mouth disease virus. J Gen Virol, 1985, 66(11): 2347–2354.

[7] Broekhuijsen MP, Van Rijn JM, Blom AJ, et al. Fusion proteins with multiple copies of the major antigenic determinant of foot-and-mouth disease virus protect both of the natrual host and laboratory animals. J Gen Virol, 1987, 68(12): 3137–3143.

[8] Morgan DO, Moore DM. Protection of cattle and swine against foot-and-mouth disease, using biosynthetic peptide vaccines. Am J Vet Res, 1990, 51(1): 40–45.

[9] Zamorano P, Wigdorovitz A, Perez-fil Gueira M, et al. A 10-amino-acid linear sequence of VP1 of foot-and-mouth disease virus containing B-and-T-cell epitopes induces protection in mice. Virology, 1995, 212(2): 614–621.

[10] Broekhuijsen MP, Blom T, Kottenhagen M, et al. Synthesis if fusion protein containing antigenic determinants of foot-and-mouth disease virus. Vaccine, 1986, 4: 119–124.

[11] Winther MD, Allen G, Bomford RH, et al. Bacterially expressed antigenic peptide from foot-and-mouth disease virus capsid elicits variable immunologic responses in animals. J Immunol, 1986, 136: 1835–1840.

[12] Shieh JJ, Liang CM, Chen CY, et al. Enhancement of the immunity to foot-and-mouth disease virus by DNA priming and protein boosting immunization. Vaccine, 2001, 19: 4002–4010.

[13] Chan EW, Wong HT, Cheng SC, et al. An immunoglobulin G based chimeric protein induced foot-and-mouth disease specific immune response in swine. Vaccine, 2000, 19(4/5): 538–546.

[14] Li G, Chen W, Yan W, et al. Comparison of immune responses against foot-and-mouth disease virus induced by fusion proteins using the swine IgG heavy chain constant region or beta-galactosidase as a carrier of immunogenic epitopes. Virology, 2004, 328(2): 274–281.