谢立，官月平，戈莹，时洪波

1 首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069

2 北京科技大学，北京 100083

丙型肝炎病毒抗原 (HCAg) 是丙型肝炎病毒(HCV) 早期感染的特异性抗原，是诊断 HCV早期感染的有效指标[1]。目前国内还没有 HCAg的临床检测试剂[2]。在前期的研究工作中已用酶联免疫吸附分析法 (ELISA) 对HCAg进行了初步检测[3]，在该方法中丙肝抗体 (抗-HCV) 通过简单的物理吸附固定在聚苯乙烯酶标板上。有人认为聚苯乙烯酶标板吸附抗原的效果优于吸附抗体的效果；经过ELISA实验过程中多次洗涤，聚苯乙烯酶标板吸附的蛋白质不断解吸附而使其浓度愈来愈低；而且适用于某种抗原-抗体系统的聚苯乙烯酶标板，对另一抗原-抗体系统未必是最合适的[4]。

为此，本研究室正在进一步研究建立新的HCAg磁性免疫检测系统，而固相载体的选择和修饰方法是建立这种新的检测系统的基础。本研究旨在探讨玻璃载体表面修饰方法对抗-HCV偶联效率和免疫活性的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

纯化 HCV基因工程表达 NS3抗原 (HCAg-NS3) (原中国预防医学科学院病毒学研究所)，戊二醛、硼氢化钠 NaBH4、辣根过氧化物酶 (HRP) 标记山羊抗小鼠IgG (Sigma公司)，牛血清白蛋白BSA (Roche公司)，HRP标记丙肝 NS3单克隆抗体(McAb) (本研究室)，其余试剂 (国产，分析纯)，酶标仪Model 680 (BIO-RAD公司)，紫外分光光度计UV-2550 (日本岛津)。

1.2 抗-HCV McAb的制备

按常规方法制备抗-HCV McAb[5]，用饱和硫酸铵法进行纯化。

1.2.1 SiO2载体的硅烷化

市售普通玻璃试管用铬酸洗液浸泡过夜，Milli-Q水清洗，加入氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)水溶液 (pH 5~6)，80℃振荡反应，水清洗后再用无水乙醇清洗。

1.2.2 SiO2载体的醛基化

在已硅烷化的玻璃试管中加入 3% (V/V) 的戊二醛水溶液，室温振荡反应，用水清洗。

1.2.3 SiO2载体与抗-HCV McAb的偶联

在已醛基化的玻璃试管中加入不同浓度的抗-HCV McAb溶液，37℃振荡反应2 h，水洗4~5次后，加入浓度为2 g/L的BSA封闭液，4℃反应过夜，用水清洗。

1.2.4 抗-HCV McAb偶联效率的吸光度测定

以稀释抗-HCV McAb的缓冲液1×PBS为空白，在280 nm波长处分别测定抗-HCV McAb与玻璃偶联前、后的吸光度值OD值。

1.2.5 抗-HCV McAb偶联效率的免疫测定

在已偶联抗-HCV McAb的玻璃试管中加入工作浓度的HRP标记山羊抗小鼠IgG，37℃反应30 min，0.02 mol/L PBST洗4~5次，TMB底物显色，以2 mol/L H2SO4终止反应，在450 nm波长处测定吸光度值。以未偶联抗-HCV McAb的玻璃试管为阴性对照。

1.2.6 HCAg的测定

在已偶联抗-HCV McAb的玻璃试管中加入不同浓度的HCAg，以10% BSA溶液为阴性对照，37℃反应1 h，0.02 mol/L PBST充分洗涤后，加入工作浓度为1∶2000的HRP标记抗-HCV McAb，37℃反应30 min，0.02 mol/L PBST洗4~5次，TMB底物显色，以2 mol/L H2SO4终止反应，在450 nm波长处测定吸光度值。加入HCAg试管的OD值与阴性对照管OD值之比大于等于2.1时判定为阳性反应。

1.2.7 统计学方法

全部数据均经SPSS13.0统计软件分析，差异的显著性用多元回归分析的F检验和相关系数的显著性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

用于偶联玻璃试管的抗-HCV McAb纯化后蛋白浓度为9.66 g/L，间接ELISA法测定效价为1∶30万。

2.1 SiO2载体制备方法对抗-HCV McAb偶联效率的影响

玻璃醛基化及蛋白质固定过程包括表面氨基化、醛基化、蛋白质的偶联及还原等步骤 (图 1)，本研究主要讨论醛基化的优化过程。

图1 抗-HCV McAb固定到玻璃上的化学过程Fig. 1 Chemical process of anti-HCV McAb immobilized onto glass.

2.2 氨基硅烷浓度和反应时间的影响

抗-HCV McAb的偶联效率受氨基硅烷的浓度和反应时间双因素影响，多元回归分析得到F=34.92，P＜0.05，故总体上认为氨基硅烷的浓度和反应时间对抗-HCV McAb的偶联效率有统计学意义。从表中可以看出，10% (V/V) 氨基硅烷水溶液处理3 h有最佳的效果 (表1)。

2.3 醛基化时间的选择

用不同醛基化时间处理的玻璃试管进行抗-HCV McAb偶联效率的免疫测定，结果显示差异有统计学意义 (r=0.912，P＜0.01)，醛基化时间为2~ 3 h，抗-HCV McAb有较高的偶联效率 (图 2)。

2.4 不同浓度抗-HCV McAb的偶联效率测定

表2数据显示，差异有统计学意义 (r=0.945，P＜0.01)，抗-HCV McAb浓度增加，偶联效率提高，在后续研究实验中，选择抗-HCV McAb浓度为8 mg/L作为与玻璃偶联的浓度。

2.5 抗-HCV McAb不同偶联时间的偶联效率测定

从表 3可知，差异的统计学意义不明显(r=0.676，P＞0.05)，在抗-HCV McAb浓度为8 mg/L时，随着抗-HCV McAb偶联时间增加，偶联效率提高不明显，所以选择3 h为抗-HCV McAb的最佳偶联时间。

表1 氨基硅烷浓度和反应时间对抗-HCV McAb偶联量的影响Table 1 Effect of aminosilane concentration and treatment time on anti-HCV McAb assay

图2 醛基化时间对抗-HCV McAb偶联效率的影响Fig. 2 Anti-HCV McAb immobilization efficiency with different glutaraldehyde treatment time. The concentration of HCV McAb in the fig was 10 mg/L, as described previously[3]. The immobilization time in the fig was overnight, as described previously[3].

表2 抗-HCV McAb浓度对偶联效率的影响Table 2 Effect of anti-HCV McAb concentration on immobilization efficiency

表3 抗-HCV McAb偶联时间对偶联效率的影响Table 3 Effect of immobilization time on immobilization efficiency

2.6 HCAg的测定

在 HCAg测定实验中，HRP标记的抗-HCV McAb与玻璃试管上偶联的抗-HCV McAb分别识别不同的HCAg抗原表位，形成有效的夹心模式检测HCAg，测定结果显示可检测HCAg至1 µg/L。

3 讨论

固相载体的质量直接关系到检测结果，有多种不同的方法用于抗体在固相载体表面的固定[6]。目前，大多数用于临床诊断的生物标志物的检测方法主要为酶免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫分析等，在这些传统方法中，蛋白质通过疏水性物理作用微弱地吸附于固相表面，固定得不牢固，且容易影响蛋白质的结构和活性。

在蛋白质固定过程中，固相支持物的选择和处理是很重要的一步，它不但要对蛋白质有较高的固定能力，而且还要保证固定在其表面的蛋白质保持活性[7]。玻璃具有廉价、表面光滑不渗透、背景低等优点，目前大多数蛋白芯片均以此作为固相载体[8]，通过化学交联法制得的固相蛋白质吸附容量大，蛋白质分子之间相互制约，吸附牢固，能够耐受多次洗涤，具有较高的反应活性[9]。本研究实验中使用的化学交联剂是戊二醛，它是目前最常用的同型双官能团化合物，其两端的醛基可与硅烷化的玻璃和蛋白质的游离氨基形成shiff碱，从而完成蛋白质在玻璃表面的固定。但是戊二醛本身能使蛋白质中毒，所以根据费嘉等[10]的报道选择 3% (V/V)的戊二醛水溶液进行反应。

Kusnezow 等[11]通过对丙基三甲氧基硅烷和多聚赖氨酸等修饰的玻片进行比较，结果显示前者最好，但是在玻璃硅烷化过程中发现，氨基硅烷的浓度和反应时间对非特异反应有较大影响，可能是高浓度的氨基硅烷较长时间反应后吸附或固定到玻璃表面上所致。

为了减少测定过程中的非特异性结合，蛋白质固定后还应进行封闭，一般选用末端具有一个或多个羧基的封闭剂，在本研究实验中选用浓度为 2%的BSA有较好的封闭效果。

总之，本研究中用于在玻璃上固定抗体的反应条件温和，可在4℃~40℃及pH 6.0~8.0内进行，操作简单，价格便宜；由于本研究应用化学交联剂固定抗体，即抗体以共价键方式固定在载体表面，而前期研究工作中用ELISA方法测定HCAg时，抗体以物理吸附方式固定在载体表面，所以前者有较大量的固相蛋白参与后续反应，因而对HCAg检测有更高的灵敏度 (ELISA法的灵敏度大于2 µg/L)，为进一步用超顺磁性纳米微球进行高灵敏度、高特异性的HCV患者血清中痕量HCAg检测提供了理论和实验依据。

REFERENCES

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[2] Zheng HJ. The prospect on the technique of test for blood donor infected with hepatitis C virus during the infectious window period. Chin J Hepatol, 2002, 14(2): 159−160.郑怀竞. 献血者丙型肝炎病毒“窗口期”感染的筛查技术展望. 中华肝脏病杂志, 2002, 14(2): 159−160.

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