白 霞,谢小磊,李 梦,耿建国,李冬华,杜宇琼

(首都医科大学中医药学院,北京 100069)

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是一种常见的消化系统疾病。现代研究发现,肠易激综合征的发病与慢性心理应激引起的脑肠轴功能紊乱密切相关。中医认为,肠易激综合征肝脾失和是发病关键,治疗应以疏肝健脾为主。本试验旨在研究加味四逆散方对肠易激综合征大鼠不同脑区核团c-fos蛋白表达的影响,探讨加味四逆散方对大鼠脑肠轴调控机制作用,为临床治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

Wistar大鼠 24只,清洁级,雄性,体重 180g～220g,购于首都医科大学实验动物科学部,动物合格证号 SCXK-(军)2007-004。正常光照条件,食、水可自由摄取,室温控制在 18℃～22℃之间。

1.2 药物

加味四逆散由柴胡 10g、白芍 10g、枳实 10g、炙甘草 10g、炒白术 10g等组成,药材购自北京国医堂大药店,加味四逆散煎煮、过滤、浓缩、配制成浓度为1.35g/m L。阳性对照药:匹维溴铵片(得舒特片),批号 610996,将药片碾碎后溶于蒸馏水配制成悬浮液,浓度为 1.79mg/m L。药物制备后,分别在 4℃冰箱保存。

1.3 主要试剂及仪器

灌注泵(保定兰格恒流泵有限公司,BT00-100M),免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),光学显微镜(Leica DMLA),图文分析软件(Leica Qwin)。

2 方法

2.1 动物模型制备

按文献方法改进,采用束缚制动加灌服番泻叶改良的方法,制备肠易激综合征动物模型。将造模大鼠置于制动筒内(自制),通过移动插片而逐步缩小大鼠的活动空间,调节到其不产生强烈反抗的紧张程度,每日制动 1次。每日开始时间及制动时间不同,第 1天为 4h,其后每次增加 30min～60min,造模大鼠在制动期间禁食、禁水。束缚制动后给予番泻叶煎剂(0.3g/ml)灌胃(20ml/Kg),每日 1次,连续21d。

2.2 分组及给药

将造模成功的大鼠随机分成模型对照组、加味四逆散组、得舒特组共 3组,每组 6只。加味四逆散组灌服加味四逆散浓缩液 10.9g/(kg·d),得舒特组灌服得舒特悬浮液 32.14mg/(kg·d),连续 21d,同时正常对照组及模型对照组大鼠灌以蒸馏水20ml/(kg· d),连续 21d。

2.3 检测方法

2.3.1 大鼠结肠转运功能 大鼠实验前 24h禁食,给予 30%水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉,取直径为 3mm的玻璃小球沿肛门放入距肛门 3cm的直肠内。大鼠苏醒后迅速移至笼内喂食饮水,笼内垫清洁滤纸。观察 2h内大鼠排便的粪点数和直肠内玻璃小球排出时间。

2.3.2 大鼠小肠运动功能 大鼠以 50%墨汁灌胃(2ml/只),10min后处死。剖取小肠,测量小肠墨汁推进百分率(推进率(%)=幽门至墨汁前沿的距离/幽门至回盲部的距离 ×100%)。

2.3.3 不同脑区核团 c-fos蛋白表达的测定采用免疫组织化学法检测。用显微镜观察各脑片cfos阳性神经元的标记,细胞核呈棕黄色为 c-fos阳性细胞。以每个单位视野(200μm)内 c-fos阳性神经元的数目来表示数量,具体判断标准为 21～30个为 +++,11～20个为 ++,2～10个为 +,2个以下为 -,每组 6只取平均值。

3 结果

3.1 药物对 IBS大鼠结肠运动功能的影响

表1显示,加味四逆散组与模型对照组结肠转运功能比较,差异有统计学意义(P<0.01或 P<0.05);得舒特组与模型组对照组比较,玻璃小球排除时间有统计学意义(P<0.05),排出粪点数有差异但无统计学意义(P>0.05)。

表1 药物对 IBS大鼠结肠转运功能的影响

表1 药物对 IBS大鼠结肠转运功能的影响

注:与模型组比较:P<0.05,P<0.01

组别 n 大鼠粪点数 玻璃小球排出时间(min)正 常 组 6 3.17±0.75 21.83±3.31模 型 对 照 组 6 4.50±0.55 15.33±1.86加味四逆散组 6 3.50±0.84 18.33±1.21得 舒 特 组 6 3.67±0.82 18.17±1.47

3.2 药物对 IBS大鼠小肠运动功能的影响

表2显示,加味四逆散组与模型对照组小肠运动功比较有统计学意义(P<0.01),得舒特组与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05)。

3.3 大鼠脑区不同核团 c-fos蛋白表达检测

表3显示,正常组大鼠纹状体偶见零星的 c-fos表达,但染色较弱;模型对照组大鼠脑皮质和纹状体的 c-fos表达多,加味四逆散可明显降低脑皮质和纹状体 c-fos阳性神经元,减少 c-fos蛋白表达。

表2 药物对 IBS大鼠小肠运动功能的影响

表2 药物对 IBS大鼠小肠运动功能的影响

注:与模型组比较:P<0.05,P<0.01

组别 n 小肠墨汁推进率(%)正 常 组 6 74.36±4.50模 型 对 照 组 6 87.44±5.41加 味 四 逆 散 组 6 75.31±5.62得 舒 特 组 6 78.75±5.56

表3 大鼠不同脑区核团c-fos阳性神经元的变化

表3 大鼠不同脑区核团c-fos阳性神经元的变化

组别 n 脑皮质 纹状体正 常 组 6 - ±模型对照组 6 ++++ +++加味四逆散组 6 ++ ++得 舒 特 组 6 ++ ++

4 讨论

C-fos原癌基因的表达及作用强度可作为判断神经细胞损伤程度的一种分子生物学标志。在正常情况下,c-fos在脑内水平极低,难以测到,多种外界刺激可诱导神经系统内 c-fos表达。目前中枢神经在 IBS发病中的作用研究较多。已有研究证实,疏肝理气、调畅情志在整体上,可能与调节慢性心理应激反应与中枢多种神经递质及其合成酶、神经肽、激素、环核普酸系统以及 c-Fos蛋白的表达有关,表现出多层次、多靶点及多环节的作用特点。

本研究根据 IBS病因病机,选用由四逆散化裁而成的加味四逆散。四逆散源于张仲景的《伤寒论》,是疏肝和脾的基础方,现代应用十分广泛,临床多用于消化系统疾病和妇科疾病等,均取得较好疗效。加味四逆散是由柴胡、白芍、枳实、炙甘草、炒白术等组成,柴胡解郁行气、和畅气机、透达郁阳;枳实行气散结;芍药合营益阴;炒白术健脾止泻;炙甘草缓急和中,具有疏畅气机、透达郁阳、健脾止泻之功效。肠易激综合征临床多表现为肝脾不和,对于IBS肝郁脾虚的病机十分合拍。

我们采用束缚制动加灌服番泻叶的方法复制IBS动物模型。研究发现,造模期间大鼠毛色干枯无光泽,烦躁易怒,喜扎堆,大便多稀溏,甚则脱肛,符合中医肝郁脾虚的诊断标准,说明动物模型制备成功。大鼠给予药物治疗后,毛色变得光泽,反应灵敏,大便逐渐恢复正常。实验结果表明,加味四逆散组大鼠玻璃小球排出的时间比模型对照组大鼠时间显著延长(P<0.01),同时大鼠排的粪点数比模型对照组明显减少(P<0.05),说明加味四逆散组大鼠结肠转运功能均有改善;加味四逆散组大鼠比模型对照组大鼠小肠墨汁的推进率明显减少(P<0.01),说明加味四逆散组大鼠的小肠运动功能亦有改善。通过慢性刺激方法,诱导 c-fos在大鼠脑区不同核团蛋白表达,显示加味四逆散能减少大鼠大脑皮质和纹状体 c-fos蛋白表达数目,说明加味四逆散方对肠易激综合征大鼠脑肠轴有重要的调控作用。加味四逆散方通过何种途径影响肠易激综合征大鼠脑肠轴的调控机制,尚有待进一步深入研究。