方肇勤,潘志强,卢文丽,刘小美,管冬元,梁 超,高必峰

(1.上海中医药大学,上海 201203;2.科罗拉多大学医学院,美国丹佛 CO 80262)

肿瘤患者的同病异证在神经-内分泌-免疫网络组织基因转录层面有没有共同的物质基础?如何从海量的芯片数据中提取其具有特征性的信息?这是证候物质基础研究需要回答的一些基本问题。鉴于此,我们对 2006和 2009年 2批实验邪毒壅盛证、气虚证、阳气虚证、气阴阳虚证等 4个同病异证荷瘤小鼠的下丘脑、垂体、肾上腺、睾丸、胸腺、脾脏等 60张芯片,近 100万个核心基因数据进行了比较分析,现报道如下

1 材料与方法

1.1 动物及分组处理

1.1.1 第 1批(2006年)实验动物 昆明种雄性小鼠 250只,体重 25g±1g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,动物生产许可证号为 SCXK(沪)2003-0003。随机取 60只做正常对照,另 190只腋下接种 H22肿瘤腹水癌细胞 0.2ml(细胞浓度 4×107个/ml),出瘤后淘汰 40只出瘤不佳及畸形小鼠,剩余 150只。取正常小鼠 20只和肝癌小鼠 150只用于四诊计量检测和辨证,另 40只正常对照小鼠不做四诊检测(用于早期、中期的正常对照组),常规饲养。

1.1.2 第 2批(2009年)实验动物 昆明种雄性小鼠 250只,体重 25g±1g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,动物生产许可证号为 SCXK(沪)2008-0003。随机取 60只做正常对照,另 190只腋下接种 H22肿瘤腹水癌细胞 0.2ml(细胞浓度 4×107个/ml),出瘤后淘汰 40只出瘤不佳及畸形小鼠,剩余 150只。剔除 10只体重过重与过轻正常小鼠,并取正常小鼠 50只以及肝癌小鼠 150只,用于四诊计量检测和辨证,常规饲养。

1.2 实验动物的诊法与辨证

采用项目组建立的四诊计量化检测工作站及计量化辨证方法,辨证出正常小鼠,荷瘤小鼠早期邪毒壅盛证、气虚证,中期阳气虚证与中晚期气阴阳虚证等同病异证[1～3]。

1.3 不同证候肝癌小鼠的处死与取材

1.3.1 第 1批接种后第 8天(早期,荷瘤小鼠死亡少于 5%),处死早期邪毒壅盛证、气虚证荷瘤小鼠各 16只;接种后第 21天(中期,荷瘤小鼠死亡至 20%左右),处死中期阳气虚证荷瘤小鼠、正常对照小鼠各 16只;接种后第29天(中晚期荷瘤小鼠死亡至 30%左右),处死气阴阳虚证荷瘤小鼠 16只,其余小鼠淘汰。分别取下丘脑、垂体、肾上腺、睾丸、胸腺和脾脏等组织。

1.3.2 第 2批接种后第 8天(早期),处死早期邪毒壅盛证、早期气虚证荷瘤小鼠各 8只;接种后第 17天(中期,依据荷瘤小鼠死亡情况确定,标准同上,下同),处死中期阳气虚证荷瘤小鼠、正常对照小鼠各 8只;接种后第 25天(中晚期),处死中晚期气阴阳虚证荷瘤小鼠 8只,其余小鼠淘汰。分别取下丘脑、垂体、肾上腺、睾丸、胸腺和脾脏等组织。

1.4 芯片检测

采用 Trizol(GIBCO BRC)试剂盒及其方法,抽提各组织总 RNA,分别将各 16个(2006年)或 8个(2009年)同证候小鼠样本合并,采用 Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其方法进行芯片检测,采用 iterPlier法计算核心基因表达读数值。芯片检测委托上海生物芯片有限公司完成。

1.5 第 1批和第 2批数据一致性分析

1.5.1 核心基因芯片读数均数校平。各组织以各证候组中最高芯片均数作为分子,求出各组均数比值,以此乘以各组读数进行校正,使各组均数一致。

1.5.2 淘汰各组织芯片数据一致小于 1/10芯片均数值以下者(假阳性及疑似表达者)。并取 2批数据一致重复的基因,进行后续的比较分析。

1.5.3 分别求出邪毒壅盛证/正常对照(邪毒 /正常)、气虚证 /正常对照(气虚 /正常)、阳虚证 /正常对照(阳虚/正常)、气阴阳虚证/正常对照(阴虚 /正常 )值 。

1.5.4 汇集所有邪毒 /正常、气虚/正常大于1.1倍者。进一步求出邪毒 /阳虚、邪毒 /阴虚值,筛选此二值一致大于 1.1者为早期邪毒壅盛证(邪毒)上调者;求出气虚 /阳虚、气虚 /阴虚值,筛选此二值一致大于 1.1者为早期气虚证(气虚)上调者;求邪毒与气虚的均数,求出该均数/阳虚、均数/阴虚值,筛选此二值一致大于 1.1者为肿瘤早期上调者。

1.5.5 汇集邪毒 /正常、气虚 /正常小于 0.91倍者。进一步求出邪毒 /阳虚、邪毒 /阴虚值,筛选二者一致小于 0.91者为邪毒下调者;求出气虚/阳虚、气虚/阴虚值,筛选二者一致小于 0.91者为气虚下调者;求邪毒与气虚的均数,再求出均数/阳虚、均数/阴虚值,筛选出二者一致小于 0.91倍者为肿瘤早期下调者。

1.5.6 取阳虚/正常大于 1.1者,再求出阳虚/邪毒、阳虚 /气虚、阳虚 /阴虚值,筛选出三者一致大于 1.1者为阳气虚证(阳虚)上调者。

1.5.7 取阳虚/正常小于 0.91者,再求出阳虚/邪毒、阳虚 /气虚、阳虚/阴虚值,筛选出三者一致小于 0.91者为阳虚下调者。

1.5.8 取阴虚/正常大于 1.1者,再求出阴虚/邪毒、阴虚 /气虚、阴虚 /阳虚值,筛选出三者一致大于 1.1者为气阴阳虚证(阴虚)上调者。

1.5.9 取阴虚/正常小于 0.91者,再求出阴虚/邪毒、阴虚 /气虚、阴虚/阳虚值,筛选出三者一致小于 0.91者为阴虚下调者。

1.5.10 取所有邪毒 /正常、气虚 /正常、阳虚 /正常、阴虚 /正常一致大于 1.1倍者,视为肿瘤上调。

1.5.11 取所有邪毒 /正常、气虚 /正常、阳虚 /正常、阴虚 /正常一致小于 0.91者,视为肿瘤下调。

1.5.12 最后取各组数据中 2006年基因与2009年一致者,统计分析。

2 结果

2.1 不同阶段 2批实验一致差异表达的基因数

2.1.1 荷瘤小鼠 3个阶段各自一致性差异表达的基因。在肿瘤发生的早期,大多组织一致差异表达的基因数量多,中期和中晚期有减少趋势(胸腺例外)。提示早期阶段的荷瘤小鼠个体差异小,随着疾病的发展,个体差异加大,遂使 06与 09两批数据中一致差异表达基因的数量减少;而荷瘤小鼠胸腺退化具有持续性和阶段性,这可能是其中晚期仍具有较高一致性的原因(图1～图3)。

图1 肿瘤早期差异表达的基因数

图2 肿瘤中期差异表达的基因数

图3 肿瘤中晚期差异表达的基因数

2.1.2 荷瘤小鼠各阶段共性差异表达的基因。肿瘤发生后的不同阶段,荷瘤小鼠神经-内分泌-免疫组织存在一些一致上调或下调的基因,其中脾脏这类基因最多。提示荷瘤小鼠脾脏基因表达改变具有一致性且持续,与肿瘤疾病的特征有关(图4);而其余组织基因表达一致性的改变与疾病的不同阶段、证候关系更为密切。

图4 肿瘤各阶段一致差异表达的基因数

2.1.3 汇总以上所有 4类一致差异表达的基因数,脾脏数量最多,睾丸、胸腺、肾上腺、下丘脑、垂体则依次递减(图5)。

图5 肿瘤所有差异表达的基因数

2.2 不同阶段 2批实验一致上调和下调的基因数

处于早期阶段的荷瘤小鼠,邪毒壅盛证和气虚证这两个证候最为集中,是典型的同病异证。邪毒壅盛证荷瘤小鼠的特点是肿瘤增长迅速,体积较同期荷瘤小鼠大,但未见明显的气虚,该证候荷瘤小鼠预后差;气虚证荷瘤小鼠的特点是气虚表现突出,而肿瘤体积却居中,预后略优于邪毒壅盛证小鼠。

2.2.1 早期邪毒壅盛证荷瘤小鼠基因表达的特征 早期邪毒壅盛证荷瘤小鼠下丘脑、垂体、肾上腺上调基因数量多于下调的数量,其中肾上腺一致上调的基因数量最多,提示其代偿活跃;睾丸、脾脏和胸腺则相反,下调的基因数量多,明显抑制。而其一致表达改变基因的数量,总体上少于同期的气虚证(图6)。

图6 邪毒壅盛证差异表达的基因数

2.2.2 早期气虚证荷瘤小鼠基因表达的特征与邪毒壅盛证比较,早期气虚证荷瘤小鼠的显著特点是下丘脑和睾丸一致性差异表达基因数增多,且模式发生了改变,下丘脑下调基因的数量增加,而睾丸表现为上调基因的数量增加,提示气虚证这两个组织基因表达相对活跃。与下丘脑对应,垂体基因表达也趋于活跃,且上调者多;肾上腺、睾丸也表现为上调基因数比例增加。总体上气虚荷瘤小鼠神经-内分泌-组织基因表达更趋活跃,共同特征显著(图7)。

图7 气虚证差异表达的基因数

2.2.3 早期荷瘤小鼠共性基因表达的特征在早期荷瘤小鼠表达改变的基因中,我们将邪毒壅盛证与气虚证比值介于 0.91～1.1的基因视为没有差异,为共性差异表达的基因,亦即其表达改变与邪毒壅盛证和气虚证关系不大,而与肿瘤疾病有关。这类差异表达基因的数量少,多在 50以内,提示荷瘤小鼠早期同病异证在神经-内分泌-免疫网络基因差异表达方面具有广泛的物质基础。其中睾丸例外,提示在肿瘤发生的早期,睾丸基因表达会发生一致性的调节改变,疾病对其影响大于证候(图8)。

图8 肿瘤早期差异表达的基因数

2.2.4 中期荷瘤小鼠基因表达特征 荷瘤小鼠发展到中期,以阳气虚证(阳虚和气虚的复合证)较为集中。阳气虚证荷瘤小鼠各组织一致性差异表达基因数偏少,提示该阶段的荷瘤小鼠个体差异较大。其中胸腺是例外,提示肿瘤发展到该阶段,胸腺基因表达的改变具有较高的一致性(图9);从形态学上看,该阶段的胸腺业已出现显著萎缩。

图9 阳气虚证差异表达的基因数

图10 气阴阳虚证差异表达的基因数

2.2.5 中晚期荷瘤小鼠基因表达特征 荷瘤小鼠发展到中晚期,以气阴阳虚证(气虚、阴虚和阳虚的复合证)较为集中。中晚期气阴阳虚证荷瘤小鼠各组织一致性差异表达基因数显著增加,提示该阶段出现了较为一致的病理改变。值得注意的是,下丘脑基因表达模式类似于邪毒壅盛证,上调者多;垂体首次出现抑制,下调基因数量大于上调者;脾脏也首次出现上调基因数量大于下调者;胸腺一致表达差异基因的数量更多(图10),与该阶段胸腺严重萎缩的病理改变一致。

2.2.6 肿瘤不同阶段荷瘤小鼠基因表达共性特征 将荷瘤小鼠不同阶段一致上调和下调的基因筛选出来,这些基因在肿瘤的不同阶段、不同证候神经-内分泌-免疫组织具有一致性的表达改变,亦即这些基因表达的改变与肿瘤疾病有关,而非证候及疾病不同的阶段。结果可见,脾脏一致性表达改变的基因数量最多,下调者多于上调者;联系到中期和中晚期胸腺基因一致性差异表达数量大增,提示肿瘤发生后,免疫系统发生了十分广泛的基因表达改变和紊乱(图11)。

在内分泌组织中,肾上腺一致性差异表达基因数量最多,提示肿瘤发生后,肾上腺受到较严重的影响或代偿最为活跃。在神经组织方面,突出改变的是垂体(图6～11)。

2.3 不同阶段同病异证一致差异表达基因的表达量

通常一些具有重要生理或病理意义的基因表达量大,为此我们进一步观察了这些上、下调基因的表达量。

2.3.1 早期邪毒壅盛证荷瘤小鼠基因表达特征 在邪毒壅盛证上调的基因中,其表达均数大多大于芯片均数,表达量较大,垂体例外(图12)。在下调的基因中,其表达均数大多小于芯片均数,表达量较小,惟肾上腺例外(图13)。提示肿瘤早期肾上腺下调的基因其生理作用可能比较重要,而肿瘤邪毒对此具有抑制作用。而且肾上腺一致上/下调基因的数量多,表明邪毒壅盛证对肾上腺产生的影响最为一致和显著,这是邪毒壅盛证的特征。

2.3.2 早期气虚证荷瘤小鼠基因表达特征与邪毒壅盛证不同的是,不同组织气虚证上调基因其表达均数大多小于芯片均数,提示大多基因上调后的生理和病理意义可能不大;惟肾上腺和胸腺例外(图14、图12)。气虚证下调基因其表达均数大多小于芯片均数,提示大多基因下调后意义可能也不大,而睾丸例外,提示气虚荷瘤小鼠生殖能力可能受到较大影响(图15)。值得注意的是,气虚证下丘脑一致上/下调基因数量多,十分活跃,构成了荷瘤小鼠早期气虚证的显著特征。

2.3.3 早期荷瘤小鼠一些共性基因表达特征在早期共性表达差异的基因中,上调者数量虽不多,但其表达量均在芯片均数以上,其中肾上腺、脾脏接近大于 3倍,胸腺大于 2倍,可能会产生较为重要的生理病理意义(图16)。而下调者数量少,表达量均数低,意义可能不大;但肾上腺和睾丸的均数在芯片均数值以上,其中睾丸为芯片均数的 3倍,提示生殖内分泌功能会受到严重影响和抑制(图17)。结合睾丸上/下调一致改变基因的数量多,提示肿瘤发病后对睾丸有较显著的影响。

图11 肿瘤独特差异表达的基因数

图12 邪毒壅盛证一致上调基因的特征

图13 邪毒壅盛证一致下调基因的特征

图14 气虚证一致上调基因的特征

图15 气虚证一致下调基因的特征

图16 早期一致上调基因的特征

图17 早期一致下调基因的特征

图18 阳气虚证一致上调基因的特征

图19 阳气虚证一致下调基因的特征

图20 气阴阳虚证一致上调基因的特征

2.3.4 中期荷瘤小鼠基因表达的特征 中期的荷瘤小鼠在上调的基因中,睾丸、脾脏、胸腺均数大于芯片总均数值(图18);在下调的基因中,垂体、肾上腺、脾脏、胸腺均数值大于芯片总均数值,其中垂体、胸腺近 2倍(图19),提示可能受到较为严重的影响。结合胸腺、脾脏上下调基因数量多,提示免疫系统受到显著的影响和抑制。

2.3.5 中晚期荷瘤小鼠基因表达的特征 中晚期荷瘤小鼠在上调的基因中,其均数均略大于芯片均数(图20);在下调的基因中惟下丘脑均数大于芯片均数(图21),提示发展至中晚期的气阴阳虚证,下丘脑基因表达紊乱十分严重;免疫组织尤其是胸腺,紊乱亦十分显著。这些构成了中晚期荷瘤小鼠基因表达的特征。

2.3.6 肿瘤不同阶段荷瘤小鼠基因表达共性的特征 在荷瘤小鼠不同阶段一致上调和下调的基因中,脾脏基因表达改变的数量、表达量均最大,提示肿瘤发生后,不同阶段、不同证候脾脏最具一致性的病理改变;胸腺一致性差异表达基因的数量少,但表达量较大,提示免疫系统的受累最为严重。在内分泌组织中,肾上腺一致性表达改变的基因数量和表达量均大于睾丸,提示受累显著。而神经组织中,垂体一致性表达改变的基因数量和表达量均大于下丘脑,提示受累显著(图22、图23)。这些组织肿瘤发生后基因表达改变及紊乱,显然与疾病关系密切,而非证候。

3 讨论

3.1 中医常见证候有没有共同的物质基础

如何从海量的芯片数据中提取其具有规律性的整体特征?为此,本文尝试对 2006年和 2009年 2批实验 60张芯片检测数据进行比较,观察是否存在一致性的基因表达改变的特征。

3.2 选择上 /下调 1.1倍筛选标准的考虑

通常芯片检测数据筛选采取上调或下调 2倍及以上;对于那些组间数据接近者,也有降低标准,采用 1.5倍者。如果仅以某批次芯片数据进行分析,这样的标准是可行的,可以筛选到大量差异表达的基因。但是,当比较 2批来自不同实验的芯片检测数据,由于种种原因,其入选一致性差异表达基因的数量会大大下降及表达量显著降低,掩盖了客观存在的差异(我们以 2006年芯片数据 1.5倍的筛选条件,分析 2009年数据就发现了这样的问题)。显然,筛选标准应予调整,需要降低门槛。为此,我们分别尝试采用梯级(1.5倍递减至 1.1倍)条件筛选、比较,发现不同筛选条件、不同组间入选基因的特征近似,但表达量和入选数量存在显著差别,随着门槛降低入选基因的数和表达量均增加。推测选择4～6个多条件的同步筛选,往往使 2批实验数据中大量数据因满足不了其中某一条件而遭淘汰,即使2批数据变化的总体趋势一致。以垂体 POMC基因(表达产物是 ACTH)为例(图24、25),在肿瘤早期阶段,该基因一致出现下调,而以下调 1.5倍条件筛选显然过于苛刻,会遗漏这样重要的改变。此外,该基因中期表达在 2批数据中的趋势不同,2006年上调,而 2009年下调,若以一致上调为条件,该基因则未能入选早期特征性下调的基因。因此,即使仅以上/下调 1.1倍为条件,多层次条件的筛选仍然是十分苛刻的,而筛选门槛抬高和条件的增加,会导致大多客观存在差异表达的基因被忽略掉。因此,我们采用了上/下调 1.1倍的多条件筛选。而 Affymetrix GeneChip先进可靠的技术和数据处理方法,使得其检测数据较为稳定、重复性好,为我们调整差异数据的筛选条件提供了技术保障。

图21 气阴阳虚证一致下调基因特征

图22 肿瘤发生后一致上调基因特征

图23 肿瘤发生后一致下调基因特征

图24 垂体 POMC基因(06年实验数据)

图25 垂体 POMC基因(09年实验数据)

以上结果还提示,2批数据 POMC早期下调趋势一致,具有重要的意义,似无必要再采用中、晚期上/下调与否去筛选(以确认其早期调整的特殊性)。这也提示,刻板地同步采用多条件筛选,依据可能不充分和不合理,需要摸索。

3.3 需要指出的是,中期阳气虚荷瘤小鼠,尤其是中晚期气阴阳虚荷瘤小鼠在早期往往肿瘤体积小、增长缓慢、证候不典型;而早期疾病和证候严重者,大多难以存活到中晚期。因此,中期阳气虚和中晚期气阴阳虚证不是由早期邪毒壅盛或气虚逐渐发展而来,没有直接递进和必然的内在联系,其不同组织基因表达的改变存在许多特殊性,不能简单理解为这几个证候的自然演变。这也从另一角度提示宜客观地看待多条件筛选的合理性。

3.4 甲状腺。甲状腺是重要的内分泌组织。遗憾的是我们在 2006年实验时,误将颌下腺作为甲状腺(并发表了部分实验结果[4～6],谨此更正并致歉)。因此,当 2009年检测甲状腺基因表达数据后,无法与 2006年的数据比较,造成了本文甲状腺数据的缺失。

3.5 本研究表明,神经-内分泌-免疫组织在肿瘤发生后的不同阶段和不同证候中,基因表达有其代表性的改变,前后 2批实验可以检测到类似的结果,表明不同证候在神经-内分泌-免疫组织基因表达层面是有其物质基础的。今后我们将陆续报道这些组织差异表达的基因。鉴于这还仅仅是 2批数据分析的结果,随着检测数据批次的增加,将有可能更为深刻、准确地刻画不同证候、不同组织基因表达的特征。

[1]方肇勤,侯俐,卢文丽,等.荷瘤小鼠证候的发生、演变、兼证及预后[J].上海中医药杂志,2007,41(1):57-62.

[2]方肇勤,潘志强,卢文丽,等.大鼠、小鼠常见证候计量化辨证方法的建立及其评价[J].中国中医基础医学杂志,2007,13(7):502-505.

[3]方肇勤.辨证论治实验方法学——实验小鼠诊法和辨证[M].第 1版.上海科学技术出版社,2006,10.

[4]卢文丽,方肇勤,潘志强,等.气虚证 H 22荷瘤小鼠甲状腺独特上下调基因的表达特征[J].山西中医,2008,24(8):44-47.

[5]卢文丽,方肇勤,潘志强,等.邪毒壅盛证 H 22荷瘤小鼠甲状腺独特上调和下调基因的检测[J].浙江中医,2008,43(9):508-511.

[6]卢文丽,方肇勤,潘志强,等.H22荷瘤小鼠不同阶段及证候的甲状腺上下调高表达基因[J].中医药导报,2008,14(11):1-6.