邹阳，崔春，赵谋明

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

酱油主要采用大豆、豆粕、小麦、麸皮、面粉等原料，经过微生物发酵以及酶促和非酶促化学反应而成，是亚洲饮食中不可缺少的调味品，目前也逐步为西方国家广泛接受［1］。研究表明，酱油不仅起着重要的调味作用，还含有许多生理活性物质，具有多种保健功能，其中以抗氧化、抗癌作用最引人注目，酱油的抗氧化性也是当今研究的热点［2－4］。

制曲是指将曲霉接种到经过预处理的原料上，并提供适宜的条件使曲霉菌等有益微生物充分发育繁殖，大量分泌酱油酿造所需要的各种酶类。制曲是酱油生产的关键环节，成曲质量的好坏对酱油的品质有决定性的影响。有研究报道［5］，酱油中大量的抗氧化物质主要是在酱油固体制曲的过程中产生的，而液体发酵阶段是抗氧化物质从固体中逐渐释放到液体中的过程，因而开展对酱油制曲的氧化性的研究是十分必要的。Lin［6］等报道了大豆经过米曲霉等发酵后其DPPH自由基清除能力、金属铁离子螯合能力、总酚含量都有明显增加。除大豆外，豆粕、小麦、麸皮、面粉等也是酱油制曲的重要原料，但对这些原料混合制曲的抗氧化性评价鲜有报道。

本研究将大豆、面粉、麸皮、豆粕、小麦粉按生产中常见的配比复合发酵，并评价酱油成曲的不同酶系的活力及抗氧化性能，为高抗氧化性能的酱油的生产提供理论和方法的指导。

1 材料与方法

1.1 原料

大豆、面粉、麸皮、小麦、豆粕:市售。

菌种:曲精(沪酿3.042孢子粉)，符合质量标准，孢子发芽率≥80%，孢子数≥100亿/g(干基)，水分≤10%。

试剂∶均为分析级。

1.2 实验仪器与设备

EL3002－电子天平，UV-2100紫外可见分光光度计，ZJP-A1230恒温恒湿培养箱，LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅，HH-8恒温水浴锅，WH-3微型旋涡混合仪，旋转蒸发器。

1.3 实验方法

1.3.1 制曲流程

酱油制作主要采用植物蛋白含量高的大豆和豆粕为蛋白原料，小麦、麸皮、玉米等作为淀粉原料。目前酱油生产中使用得最多的原料是大豆、豆粕、小麦、麸皮，我国传统发酵酱油使用的配比为大豆与小麦质量比为100∶40和100∶50，豆粕与麸皮质量比为100∶10和60∶40。日本酱油制曲采用的原料配比一般为:m(脱脂大豆):m(小麦)为50∶50 或60∶40［7］。本文采用如表1的原料配比。

表1 原料配比质量分数 %

大豆清洗，浸泡5～6 h，以1∶1质量比润水，豆粕于121℃高压蒸煮12 min，冷却至40℃左右，按表1比例分别与面粉、小麦粉、麸皮混合拌匀，接种酱油曲精，平铺在各曲盘，按文献［8］在恒温恒湿培养箱培养44h。培养过程中注意及时翻曲，以调节温度和湿度，控制品温不超过38℃。44 h后取出酱油成曲，冷藏备用。

1.3.2 福林酚法测定中性及酸性蛋白酶活力［9］

1.3.3 β-葡萄糖苷酶活力测定［10］

1.3.4 淀粉酶活力测定［11］

1.3.5 提取溶剂的选择

以索氏抽提法［12］对酱油成曲粉脱脂。称取5份均为4.000 g的脱脂曲粉，分别加入80 mL蒸馏水、80%乙醇、80%丙酮、17%盐水、80%甲醇，振荡提取1 h，取出真空抽滤，所得滤液进行旋转蒸发浓缩至干，称重用于计算提取率，再将提取物溶解定容至50 mL测定抗氧化性。

1.3.6 DPPH自由基清除能力测定［13］

将曲粉溶解，精确吸取稀释液2 mL，与2 mL浓度2×10－4mol/L的DPPH·溶液混合均匀后避光放置30 min，测定517 nm处的吸光度值(A样品);测定2 mL样品稀释液加2 mL乙醇在517 nm处的吸光值A对照以及2 mL蒸馏水与2 mL DPPH溶液在517 nm处的吸光值A空白。

1.3.7 ABTS+清除能力测定

ABTS+储备液制备:以去离子水将 ABTS+和K2S2O8分别溶解并混合，使其终浓度分别为7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室温、避光条件下静置12～16 h，该储备液可稳定3～4 d。测定时，将ABTS+储备液以磷酸盐缓冲液(10 mmol/L，pH 7.4)稀释，使其吸光度达到0.700±0.020(734 nm波长下)，形成ABTS+测定液。吸取4.0 mL ABTS+测定液，加人40 μL Trolox或样品稀释液，准确振荡30 s，测定避光反应6 min后734 nm处的吸光值。计算Trolox当量，即 TEAC 值［14］。

1.3.8 还原能力测定

取2 mL样品液加入2.5 mL磷酸盐缓冲溶液(pH值6.6)及2.5 mL1%铁氰化钾，50℃保温20 min，再加2.5 mL10%三氯乙酸混匀，加2.5 mL蒸馏水及0.5 mL 0.1%三氯化铁，于700 nm波长比色［15］。以Trolox做标准曲线，计算Trolox当量。

1.3.9 总酚含量测定

精确称取0.005 g没食子酸标准样品，蒸馏水溶解并定容至50 mL。该标准液浓度为0.1 mg/mL。准确量取上述标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于20 mL刻度试管中，各加6 mL水，摇匀，再加2.5 mL Folin-Denis试剂，充分摇匀。3 min之后，加入1mL 20%Na2CO3溶液，补足至10 mL，充分混匀，75℃水浴10 min，于760 nm处测吸光值，建立标准曲线［16］。取100 μL样品液同标准曲线的做法测定总酚含量，以100 μL蒸馏水代替样品液，作为空白对照［17］。

2 结果与分析

2.1 酱油成曲的中性和酸性蛋白酶活力

成曲的好坏直接影响后续发酵的进行，酱油发酵前期主要是中性蛋白酶起作用，把原料中蛋白质分解成多肽和氨基酸，产生酱油理化指标成分全氮、氨基酸态氮。酱油发酵后期由于pH值下降，因此酸性蛋白酶起了主要的作用。有研究表明［18］，原料中蛋白质经蛋白酶降解作用后产生的多肽类和氨基酸与还原糖作用产生的褐色色素类物质具有抗氧化作用。

图1 四种酱油成曲的蛋白酶活力

由图1可知，中性蛋白酶活力强弱顺序为:成曲2号＞成曲4号＞成曲1号＞成曲3号;酸性蛋白酶活力也呈现出相似的趋势。2号、1号和4号都是以大豆为原料发酵而成，而3号是由豆粕发酵而成，总体来看，大豆制作的酱油成曲的中性和酸性蛋白酶活力比豆粕制作的酱油成曲高。豆粕为大小不一，形状不规则的扁平颗粒，与小麦粉混合后空隙小，在制曲过程中通风情况不好，影响了曲的生长情况，生长情况不如大豆的好，因此以大豆制得的成曲的蛋白酶活性高于豆粕。成曲2号的中性和酸性蛋白酶活力是最高的。从原料来看，2号采用了麸皮作为辅料。有研究表明［19］，麸皮富含淀粉和蛋白质，多种维生素，钙、铁等无机物，且质地疏松，表面积大，有利于米曲霉生长和产酶，因此添加麸皮制曲会使蛋白酶活力提高。

2.2 酱油曲的淀粉酶活力和β-葡萄糖苷酶活力

研究表明［20］，大豆异黄酮具有很好的抗氧化作用，而游离型异黄酮比糖苷型异黄酮的抗氧化作用更强。大豆原料中的异黄酮主要以糖苷型异黄酮形式存在，在发酵过程中微生物能够分泌β-葡萄糖苷酶，糖苷型大豆异黄酮在β-葡萄糖苷酶的作用下部分转化为游离型大豆异黄酮，使抗氧化作用明显提高。淀粉酶将淀粉水解成还原糖，与氨基酸作用可以产生美拉德反应生成具有良好的抗氧化活性的褐色物质，而且淀粉酶与β-葡萄糖苷酶有利于原料中多酚物质的释放［21］，对酱油的抗氧化作用也起了重要作用。

溶剂的极性对成曲中的抗氧化活性物质的提取具有重要的影响，而不同的抗氧化活性物质对不同的抗氧化力评价方法的响应也不同［23］，因此，明确提取溶剂对成曲中的抗氧化活性物质的提取能力与选择性是评价成曲抗氧化力的前提和基础。本实验采用5种溶剂来提取(表3)，以确定最适合的提取溶剂。

表3 不同溶剂提取物清除DPPH和ABTS+自由基能力

表2 四种酱油成曲的淀粉酶活力和β-葡萄糖苷酶活力

由表2可知，4种酱油成曲的淀粉酶和β-葡萄糖苷酶活力的强弱为:成曲3号＞成曲4号＞成曲2号＞成曲1号。一般来说，酱油曲的原料组成与大部分微生物培养基一样，由碳源和氮源组成。大豆与豆粕蛋白质含量丰富，适合作为米曲霉的氮源，而小麦粉、面粉被米曲霉分泌的淀粉酶水解，提供其生长必须的碳源。在一定范围内，提供的碳源越多，米曲霉的生长越旺盛，分泌的淀粉酶和β-葡萄糖苷酶也更多。3号与4号曲的原料比1号和2号曲的原料能够提供更高的淀粉含量，适合米曲霉的生长，因此具有更高的淀粉酶活力和β-葡萄糖苷酶活力。研究表明［22］，麸皮为曲霉发酵产酶的最佳碳源，可能与麸皮的组成成分有关，即麸皮中易利用的糖类含量低，不致产生分解代谢产物阻遏，而且麸皮中含有一定量的有机氮，可以满足微生物对有机氮的生长需要，因此成曲2号的淀粉酶及β-葡萄糖苷酶活力比1号高。

2.3 提取溶剂的确定

由表3可知，酱油成曲丙酮溶液提取物的抗氧化效果最好，提取物干重仅19 mg/mL，而DPPH清除率达到56.19%，TEAC值也最高达到68.81(μmol/g)，故选择丙酮作为提取溶剂。

2.4 四种酱油成曲的抗氧化性评价

2.4.1 清除DPPH及ABTS+自由基能力

由表4可知，成曲清除DPPH的能力强弱为:2号＞1号＞4号＞3号。4种成曲在经过原料发酵后其清除DPPH能力提高，清除ABTS+的能力也有明显增加，说明在制曲的过程中生成了新的抗氧化物质。大豆发酵的1号、2号、4号成曲其清除DPPH自由基的能力高于豆粕发酵的3号成曲。研究表明，大豆中含有异黄酮，多肽，大豆皂苷等具有抗氧化活性的生理活性物质［24］，而豆粕是采取有机溶剂对大豆脱脂而成，而异黄酮可溶于有机溶剂中，因此在大豆加工成豆粕的过程中，大豆中的异黄酮等可能有一部分溶于有机溶剂中而流失，因此由大豆发酵的成曲的抗氧化性高于豆粕发酵的成曲。与1号成曲相比，以麸皮替换部分面粉的2号成曲的DPPH清除能力稍高，可见添加麸皮有利于提高清除DPPH自由基的能力，这也在相关研究中有证明［25］。

表4 四种酱油成曲及原料清除DPPH及ABTS+自由基能力

在清除ABTS自由基方面，清除ABTS+自由基能 力强弱为:1号＞2号＞4号＞3号。清除DPPH和ABTS+自由基能力的结果基本一致。1号、2号成曲清除ABTS+的能力较4号高，可能是因为1号、2号使用了较高的大豆与碳源比(4∶1)来发酵，而4号的大豆与小麦粉质量比为1∶1。由此可见，大豆的含量对成曲的抗氧化能力起了重要作用。4号成曲的ABTS自由基清除能力较未发酵的原料提高达6倍，可能是由于4号成曲的β-葡萄糖苷酶活力较高，大豆异黄酮苷被β-葡萄糖苷酶水解成为异黄酮苷元，异黄酮苷元具有更高的抗氧化性，使得成曲的抗氧化活性增加［20］。

2.4.2 还原能力

由表5可知，成曲的还原能力的强弱为:1号＞2号＞4号＞3号。原料的还原能力相当，经过发酵制曲后，成曲的还原能力有了明显的提升，1号、2号、4号成曲原料中都使用了大豆，3号成曲原料使用了豆粕，说明大豆发酵而成的成曲的还原能力强于豆粕发酵而成的成曲。此外，1号和2号的大豆与小麦粉的比例分别为4∶1与4∶0.8，4号的大豆与小麦粉的比例为1∶1，也印证了提高原料大豆比例对成曲还原能力具有正向的影响。2号添加了麸皮作为辅料，其还原能力相对于1号并没有增加，说明添加麸皮对还原能力没有影响。

表5 四种酱油原料及成曲的还原能力

2.4.3 总酚含量测定

图2 四种酱油成曲及原料的总酚含量

由图2可以看出，成曲的总酚含量与抗氧化能力顺序一致，即由大豆作为氮源发酵的成曲的总酚含量高于由豆粕作为氮源发酵的成曲。此外，原料经过发酵成为成曲后其总酚含量有明显提高，研究表明［21］，通过制曲发酵后的大豆的总酚含量有很大提高，且淀粉酶与β-葡萄糖苷酶对总酚的提高都有作用，β-葡萄糖苷酶的作用较大。成曲1号的总酚含量相对于原料提高了3.64倍，成曲2号相对于原料提高了4倍。4号相对于原料总酚含量提高了5.5倍，在4种成曲中总酚含量提高得最多，可能是因为β-葡萄糖苷酶活力较高，有研究表明［21］，β-葡萄糖苷酶有利于酚类物质的释放，使得总酚含量增加。

3 结论

(1)不同原料制作的酱油成曲的抗氧化活性有明显差异，总体上看，以大豆为原料发酵的成曲抗氧化性比豆粕发酵的成曲的抗氧化性高。

(2)原料通过发酵制曲后，成曲相对与原料其清除DPPH自由基及ABTS+自由基的能力、还原能力、总酚含量都有数倍的提高。从本实验的结果来看，提高大豆在制曲原料中的比例，以及使用小麦粉作为米曲霉生长的碳源，可以大大提高酱油成曲的抗氧化性，有利于制备抗氧化性更好的酱油。因此适当的原料配比对制备抗氧化性更好的成曲也起了重要作用，后续可围绕优化原料配比展开。

(2)蛋白酶、淀粉酶、β-葡萄糖苷酶的活力与酱油成曲的抗氧化性有一定的关系，但蛋白酶与淀粉酶的酶活力与抗氧化性的具体关系有待于进一步研究。

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