赖新生 王 黎等

赖新生 王 黎 江雪华 陈振虎 曾 强

(广州中医药大学,广东510407)

摘 要 采用4-血管阻断模型,用Morri水迷宫测定大鼠学习记忆能力,并检测大鼠脑组织内SOD酶活性及MDA含量。结果电针及尼莫同治疗组能显著缩短定位航行试验的潜伏期;在空间探索试验中,在原平台象限跨越平台次数显著多于其余象限,与正常组无显著差异;大鼠脑组织内SOD酶活性上升,MDA含量明显降低。提示电针能改善VD模型大鼠的学习记忆能力,并能增强机体清除自由基的能力,对阻止自由基对脑组织的进一步损害有积极意义。

主题词 电针 痴呆,血管性/针灸疗法 学习障碍/针灸疗法 记忆障碍/针灸疗法 超氧化物歧化酶/代谢 丙二醛/分析血管性痴呆(VascularDementia,VD)是我国最常见的老年期痴呆类型,系由脑血管因素引起的脑循环障碍、脑组织受损导致的一种认知功能缺损的综合征。由于痴呆造成病人记忆、认知等方面的障碍,不仅影响病人的生活质量,而且造成巨大的社会和家庭负担,本病成为当今医学紧迫攻关的课题之一。在对血管性痴呆的发病机制尚未完全搞清、临床缺乏理想药物的情况下,针灸对VD的智能及社会活动功能康复有积极作用,其疗效肯定,但有关机理方面的实验研究尚缺乏[1],我们采用4-血管阻断(4-Vesselocclusion,4-VO)全脑缺血模型,模拟临床上VD的发病特点,建立近似人类学习记忆障碍的大鼠VD模型,观察电针对模型大鼠学习记忆能力、脑内超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量的影响,旨在探讨针刺治疗血管性痴呆学习记忆功能障碍的机理。

1 材料1.1 动物及分组成年健康雄性SD大鼠40只,体重200～250g,由广州中医药大学实验动物研究中心提供。按体重随机分为正常组、电针组、西药组和模型组,每组各10只。

1.2 仪器Morris水迷宫,722分光光度计(上海第二分析仪器厂产品),G8605电针仪(上海)。

1.3 药品及试剂尼莫同(由德国拜耳公司提供,批号:CAGFT3)、SOD、MDA、总蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)。

2 方法2.1 模型制作方法模型组、电针组、西药组动物按4-血管阻断(4-Vesselocclusion,4-VO)方法制作模型。用10%水合氯醛(0.6ml/100g体重)腹腔麻醉大鼠,背侧颈正中切口,暴露双侧第一颈椎横突翼小孔,用直径0.5mm电凝针插入双侧翼小孔烧灼双侧椎动脉,造成永久性闭塞,24小时后腹侧颈正中切口,分离双侧椎动脉,用微动脉夹可逆性夹闭颈总动脉5min,共夹闭3次,每次间隔1小时,常规饲养、观察。正常组常规饲养,未经任何处理。

2.2 治疗方法术后7天,刀口完全愈合,饮食正常,无肢体残疾,开始给予治疗。

(1)电针组 用28号1寸毫针,于模型大鼠头部"百会"、"大椎"穴(取穴参照林文注等编著的《实验针灸学》)捻入0.5寸,连接电针仪,该项目为广东省自然科学基金资助项目(960548)

施以连续波,频率150Hz,强度以大鼠安静耐受为度(约2.0A),于每天电针1次,留针20min,连续治疗10天。

(2)西药组 大鼠给予尼莫同12mg/kg,按20ml/kg体重灌胃,每日1次,连续10天。

(3)正常组和模型组未予任何治疗。

2.3 检测方法(1)Morris水迷宫行为学检测[2]水迷宫由直径130cm、高50cm水池组成,水深30cm,水温26±1℃。在水池壁标明4个入水点,由此将水池等分为4个象限,任一象限正中放置一个直径12cm、高29cm无色透明的平台,没于水下1cm,水面覆盖塑料泡沫,于术后第18天开始水迷宫试验。程序包括(1)定位航行试验(placetest),历时6天,每天4次,将大鼠从4个入水点面向池壁放入水中,记录2min内寻找平台的时间(逃避潜伏期,es-capelatency);(2)空间探索试验(spatialprobetest):定位航行试验结束后撤除平台,然后将鼠任选一入水点放入水中,测其2min内跨原平台及其余3个象限相应平台位置的次数和大鼠在水迷宫外环停留时间。

(2)生化指标检测水迷宫试验结束后,大鼠脱椎法处死,迅速断头取脑用预冷的生理盐水冲净表面血液,以滤纸吸干,去除软脑膜血管,取右脑称重,以重量/体积(W/V)比1∶9加入冰生理盐水,制成10%的匀浆,3000r/min离心15min,取上清液。磺嘌呤氧化酶法测SOD活性,硫代巴比妥酸法测MDA含量,Lowry法测组织蛋白含量,严格按照试剂盒说明进行操作。

3 结果3.1 行为学检测结果测试时大鼠饮食正常,体重恢复到原有水平,无肢体残疾。

(1)定位航行试验4组大鼠在历时6天训练中,寻找平台的平均潜伏期变化(见图1)。

如图1所示,正常组、电针组和西药组大鼠均随着训练次数增加,潜伏期越来越短。每组组内潜伏期经单因素方差分析,有非常显著性意义(P<0.01)。这3组潜伏期一开始呈急速下降趋势,随后呈持续稳定下降,正常组平均潜伏期为30.46s,电针组30.56s,西药组32.46s。而模型组潜伏期虽有缓慢下降趋势,但经单因素方差分析相互无显著差异(P>0.05),平均潜伏期69.67s。这表明模型组大鼠学习获取能力较差。将4组大鼠平均潜伏期进行组间单因素方差分析,有非常显著性差异(P<0.01),并做组间两两比较,结果显示电针组大鼠平均潜伏期明显短于模型组(P<0.01),而正常组和西药组与电针组之间的差异无显著性意义(P>0.05),这表明电针能够改善模型大鼠的学习巩固和再现能力。

(2)空间探索试验撤除平台,4组大鼠2min内跨越原平台及其余3个象限相应平台位置次数(见图2)。

如图2所示,正常组大鼠在原平台象限跨相应平台次数为6.2次,其余R、O、L3个象限跨相应平台次数分别为1.4,0.8,1.0;电针组大鼠在原平台象限跨相应平台次数为6次,其余R、O、L3个象限跨相应平台次数分别为1.8,0,0.3;西药组大鼠在原平台象限跨相应平台次数为5.5次,其余R、O、L3个象限跨相应平台次数分别为1.3,0.8,0.5,3组在原平台象限跨相应平台次数明显多于其余3个象限(P<0.01)。模型组在原平台象限跨越相应平台次数为1.5次,另外3个象限分别为1.2,0.7,0.3,4个象限无显著差异(P>0.05)。将4组大鼠在原平台象限跨越相应平台次数做两两比较,电针组明显多于模型组(P<0.01),与西药组和正常组无显著差异(P>0.05)。在水迷宫外环逗留时间正常组平均为40.3s,电针组为40.4s,西药组为47.5s,模型组为75.8s,模型组逗留时间比其它3组明显延长(P<0.05)。3.2 生化指标检测 见表1表1 电针对脑组织内SOD活性、MDA含量的影响(珔x±s)组别nSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)正常组107.12±0.441.53±0.07车缯胱107.34±0.36△2.10±0.62△澄饕┳107.01±0.26△2.36±0.68△衬Ｐ妥105.71±0.603.69±0.79△与正常组比较,P>0.05;秤肽Ｐ妥楸冉,P<0.01如表1所示,与正常组相比,模型组SOD活性显著降低(P<0.01),MDA含量明显升高(P<0.01)。而电针组与正常组和西药组比较无显著差异(P>0.05),电针组与模型组比较,其SOD活性和MDA含量有非常显著性差异(P<0.01)。

4 讨论随着社会的老龄化,血管性痴呆已成为日益严重的社会问题,目前尚未找到改变疾病进程的方法,但是国内外学者一直在研究。在基础研究中认为反复性脑缺血是VD的主要病因之一[3,4],而自由基是脑缺氧后神经细胞损害的重要发病因素。自由基生成系统对学习记忆亦有明显的损害作用,自由基对脑缺血的损伤是多方面的,无论是对急性期脑血管或脑实质损伤,还是脑血管损伤后的继发性损伤均起重要作用。它对智力的损害主要由于自由基对细胞及细胞膜上不饱和脂肪酸的破坏和过氧化及MDA产生。MDA是自由基对生物细胞膜损伤和主要代谢产物,它能交链蛋白质、脂类、核酸及糖类,致使生物膜变性和破坏,由于DNA发生突变、交链等影响了信息传递、转录和复制,导致蛋白质合成能力或合成蛋白质功能紊乱,从而表现出记忆力和智力下降。SOD是重要的金属酶,为机体直接清除自由基的重要酶类,是机体防御新陈代谢及其他生命活动中氧自由基损伤和破坏的抗氧化酶[5]。其主要功能是将氧的单价还原产物O-2·歧化成H2O,以免它们分解形成强氧化活性的自由基重新对其它不饱和脂肪酸分子发生氧化作用,从而阻断自由基损伤[6,7]。临床报道表明[1],针灸治疗VD的疗效是肯定的,但是基础理论和实验方面的报道很少见。本实验采取被广泛应用的4-血管阻断法(4-VO),引起全脑缺血,其中有再灌注损伤,和人类血管性痴呆的发病机理有很大的相似性。实验结果亦表明,缺血再灌注损伤后,实验动物出现明显记忆障碍,大鼠脑组织的SOD活性明显下降,MDA含量明显增加。我们采取电针大鼠"百会"、"大椎"穴,检测其学习记忆行为,结果表明,能缩短模型大鼠水迷宫潜伏期,能改善其记忆成绩。通过对SOD活性和MDA含量的检测,结果表明电针能增强痴呆大鼠脑内SOD活性和降低MDA含量。"百会"和"大椎"均为督脉穴位,百会为"三阳五会",大椎为"诸阳之会",督脉与脑密切相关,督脉通于脑。病变在脑,首取督脉。电针2穴能疏通经气、通调督脉、醒脑开窍、益智复聪。实验结果表明电针能明显改善痴呆大鼠的学习记忆能力,对阻止自由基对脑组织的进一步损害有积极意义。

尼莫同是钙通道阻滞剂,进入脑组织后能高度特异性地和海马、皮质的神经元以及大脑内参与学习和记忆区域的钙通道受体结合。相互调节钙离子流入神经细胞,从而影响神经元电学性质及神经介质的平衡,同时也能通过钙离子流向平滑肌细胞,调节血管张力,是近年来常用于治疗VD的西药。本动物实验表明,电针和尼莫同对痴呆大鼠记忆障碍均有显著改善作用,显示出针刺治疗VD的潜力,也向我们提示针刺治疗VD可能与调节钙离子有关,因此,可以设想针刺对VD的治疗可能是多途径、多环节、多效应的结果,其有关机理需待进一步深入研究。

5 参考文献1 莫非智,赖新生.针灸治疗血管性痴呆临床研究概况.中国针灸,1998:18(6):5792 MorrisRGM.DevelopmentsofaWaterMazeProce-duceforStudying,SpatialLearningintheRat.JNeruosciMeth,1984;11:473 KawanoH,VedeK,HasuoY,PrevalenceofDementiaandEvaluationofItsClinicalDiagnosisDuring3-yeatFollow-upStudyinJapaneseCommunity.Stroke,1990;21:14 Corey-BloomJ,ThalLJ,Calaskod,etal.DiagnosisandEvaluationofDementiaNeurology,1995;45:2115 丁克祥.SOD临床研究集.北京:原子能出版社,1992:16 霍淑芬,孙桂莲,严超英.自由基与新生儿缺氧性脑病.中风与神经疾病杂志,1995;12(2):797 梁勇.氧自由基与脑损伤和脑水肿.国外医学.神经病学神经外科分册,1995;22(20):81(收稿日期:1999-08-11,齐淑兰发稿)