敖义鹏，何强治，周志鹏，屈富波，招昌君

陕西省城固县畜牧兽医工作站，陕西 城固 723200

新城疫、禽流感等有血凝素(HA)的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，这是一种利用抗原抗体的特异性反应来测定抗原或抗体的检测技术，该技术是目前WTO 进行全球禽流感监测普遍采用的试验方法[1]，具体就是制备1%的禽无抗红细胞悬液，测定抗原效价，然后根据抗原效价配制4 IU 抗原，再用4 IU 抗原测定抗体，如果待检样品中有抗体，抗体会与抗原结合，红细胞就会沉淀于微量反应板孔底，倾斜微量反应板时，红细胞就会出现流淌现象，如待检样品中没有抗体，则抗原就会与红细胞发生凝集反应，倾斜反应板时，红细胞就不会发生流淌现象，根据这一方法判定抗原或抗体效价高低。

1 常见问题

1.1 红细胞悬液制备问题

在红细胞悬液制备时，常见问题主要有：供制备红细胞悬液的禽的选择不符合要求，如供制备红细胞的禽为非无抗禽，供样禽数量不符合要求，红细胞溶血、配制浓度不达标等。

1.2 抗原配制问题

抗原效价测定不准确，其他相关因素控制不严引起抗原效价测定结果失真。

1.3 操作规范问题

移液枪头不畅，移液器未经校核定量，操作不规范（未按规定时间、剂量和顺序操作），操作前试剂没有混匀和预温，实验用器械未经严格清洗消毒造成的污染等。

1.4 结果判定问题

试验条件不成立，不符合判定标准，不在规定时间内判定结果，对判定依据把握不准确等。

2 对 策

2.1 规范制备红细胞

1）非免疫鸡的选择：供制备1%红细胞的鸡，必须是未免疫新城疫、禽流感疫苗、未发生相应疫病的公鸡，至少2～3 只。

2）防止溶血：采血时避免外源污染，采血针头应选择较大号的，抽吸时用力不要过大，采鸡血前先吸取3～5 mL 稀释液可有效防止采样过程中的溶血或血液凝固（特别是高温情况下，鸡血凝固速度较快），避免酒精接触鸡血或红细胞，采集的鸡血应该溶于预先准备好的经过灭菌处理的PBS 液中，并轻轻混匀，在离心制备红细胞前不能长期静置，防止血液凝固。异物也容易引起血液凝固。

3）制备1%鸡红细胞：洗涤红细胞时，应先混匀红细胞，取上层红细胞悬液用于离心，避免凝集血块夹杂其中；红细胞洗涤要彻底，一般至少3～5 次，充分去除其他非红细胞成分；离心速度一般1 800～2 500 r/min、5～8 min，初次离心选择较低速度，防止高速离心造成红细胞堆积过紧实出现粘连，随着洗涤次数的增加，离心速度依次增加、时间延长；制备的红细胞体积符合要求，若离心速度低、时间短，红细胞因夹杂过多洗涤液、红细胞压积不实，则制备的红细胞浓度会小于目标浓度；在实际操作中，往往需采集2～3 只公鸡血液用于制备1%的鸡红细胞，有时也会出现红细胞部分溶血现象，只要对红细胞进行充分洗涤，仍可制备出符合要求的红细胞；判定红细胞是否溶血的技巧是将制备好的1%的鸡红细胞悬液静置后，看上清液是否澄清，若清澈说明合格，若呈红色说明红细胞有溶血现象[2]，应弃去重新制备。

4）红细胞制备效果评判依据：离心红细胞时若洗涤液逐步变清，表明红细胞制备比较成功；将制备的红细胞移入PBS 稀释液时，有明显的云雾状扩散现象，表明红细胞制备较好。如红细胞经离心后，上清液始终呈红色，数次离心后仍呈红色，表明红细胞有溶血，则制备的红细胞不可用；如果红细胞加入稀释液中呈红色，且经过数小时仍呈红色，表明红细胞有溶血现象，不可用；制备的红细胞若出现凝血块，红细胞不可用。

1%鸡红细胞应现配现用，确需延长时间使用时，应在2～8 ℃下保藏，时间一般不超过3 d。在使用1%鸡红细胞前，应先观察上清液是否澄清，若上清液浑浊或容器底部红细胞平铺不均匀、有结块现象等，则不可用。

2.2 精准操作

1）正确制备红细胞悬液是精准测定抗原效价的前提。1%鸡红细胞制备的准确性，影响抗原和抗体效价的测定，若制备的红细胞浓度增大，则抗原、抗体效价测定时会被降低，因此必须准确配制1%鸡红细胞悬液。

2）准确配制4 IU 抗原。每次试验时，都要对抗原进行标准化测定，4 IU 抗原尽量现配现用，用测定抗原效价的同批次1%的红细胞进行试验检测，防止不同批次的1%的红细胞因浓度差异而影响抗体效价准确测定。按照血凝抑制试验操作步骤进行4IU 抗原配制，完成配制后，应对4 IU 抗原再进行一次抗原效价测定（回归试验），若4 IU 抗原效价为2 log2，试验有效，表明4 IU 抗原配制准确，否则应重新配制[3]，4 IU 抗原配制浓度高了易出现样品抗体假阴性，反之易出现假阳性结果，因此必须精准配制4IU 抗原。

3）待检血清必须符合检测要求。待检血清必须清亮，无溶血、无果冻样凝固、无腐败变质、无红细胞等物质掺杂。若血清中含有红细胞，在进行抗体效价测定时会出现比实际值高的现象。要严防样品腐败变质，血清或抗体的主要成分是蛋白质，如储运不当，可导致其变质变性，从而影响检测结果。为防止禽血清出现果冻样凝固，尽可能采集青年禽血样，采样宜在禽进食前进行，采集的禽血清以自然析出最佳，确需离心时应静置2 h 以上再进行离心。供样动物机体状况对结果也有影响，若动物脱水、血液浓稠度高等对抗体浓度也有影响。

4）准确定量。如稀释液、红细胞悬液、抗原、样品等配制浓度必须准确、使用前充分混匀，使用时准确量取，对反应时间和结果判定时间要严格控制。在使用多道移液枪时，操作人员要注意观察移液器吸头液面高度，若出现不一致，可能是滴头堵塞或是移液器出现故障，应及时排除影响。

5）严格比对。对待检样品进行检测前，一定要做好“3 个对照”即阳性对照、阴性对照和空白（稀释液）对照，只有3 个对照成立，检测结果才有效。

2.3 科学研判结果

1）判定标准：抗原效价测定时的判定标准是“能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度”，样品抗体效价测定时的判定标准是“以完全抑制4 单位抗原的血清最高稀释度”[4]，上述2个判定标准必须准确把控，不得用“50%凝集”判定。同时判定红细胞沉淀还是凝集时，一定要结合红细胞均匀分布于稀释液体系还是沉淀于孔底、形状、色泽以及倾斜反应板观察时的红细胞流动状态，如流淌速度、长度和数量等综合研判。

2）正确判定：判定结果时，应将反应板倾斜45～60°进行观察，红细胞完全凝集时，均匀布于反应孔中，有时红细胞凝集时会出现片状凝集甚至皱缩成团（超凝）现象，易与红细胞的沉淀现象混淆，可通过3 种方法鉴别：一是察颜色：红细胞完全凝集或出现超凝时，红细胞均匀分布于反应孔中略呈灰色，如果因超凝形成可见凝集物时的凝集物颜色往往呈灰色或灰褐色，与正常沉淀的红细胞的鲜红色形成鲜明对比；二是观状态：红细胞完全凝集时，红细胞呈均匀分布状态，且在反应孔底内呈连续、整齐、均匀分布，偶尔也会出现凝集片、甚至凝集片状物边缘不整齐或出现皱缩（超凝）现象；红细胞沉淀时，会在反应孔底出现纽扣状沉淀，且有向孔底集中趋势；在PBS 液对照孔结果正确的情况下，将血凝板倾斜，从背侧观察，结果更加清晰[5]；三是看规律：试验中，样品是按照对倍规律稀释的，沉淀或凝集反应也是有规律的，加入红细胞后，同一样品的对倍稀释孔会出现由沉淀到凝集或者由凝集到沉淀的有规律状态，如果出现个别孔结果异常，表明试验操作不当，应重新进行检测。当倾斜反应板时，沉淀的红细胞对照孔会出现“流泪”现象，且红细胞流淌速度、长度和数量正常；出现超凝的反应孔一般不会出现红细胞流淌，或者凝集物流淌极为缓慢；要注意样品孔与红细胞对照孔红细胞的状态对比，一般阴性时则表现同步流淌，且流淌速度、数量和线形基本一致，反之亦然。

2.4 严控试验条件

1）温度和时间：该试验一般宜在15～25 ℃条件下进行，HA 和HI 试验中加入红细胞后判读结果的时间一般为30～40 min，具体参照红细胞对照孔，对照孔完全沉淀时要迅速判读结果。温度高则反应速度加快，判读时间缩短，但温度过高（超过37 ℃），凝集的红细胞容易洗脱，红细胞很快沉淀下来，导致试验不成立[6]；温度低，则反应速度减缓，判读时间延长。同时要适时掌握判读时间，判读时间过早，出现凝集不全，判读时间过迟，会出现洗脱现象，亦会影响结果的准确判定。

2）样品质量：血清样品应澄明、无污染、无杂质、无红细胞，否则会影响实验结果；注意消除非特异性凝集因子影响，尽可能采集同种家禽的血制备红细胞悬液。

3）试剂贮用：试剂保藏、运输必须在适宜的温度范围内，严防高温、反复融冻、曝晒、剧烈震荡等不利因素对试剂效价的影响，试剂、1%鸡红细胞、PBS 液等使用前都要充分混匀并预温后使用[7]，抗原和抗体都要现配现用，确需延长使用时间，一般应在2～8 ℃条件下保藏，不超过3 d，否则影响试验结果。

4）试验环境：所有试剂尽可能现配现用，确需延长使用时间的，一定要按要求规范保藏；所有操作应在无菌环境中进行；容器、稀释液等均应经严格灭菌、消毒。

5）操作规范：移液器、天平等定量工具要定期校核；血凝板选用90°板，不得用110°板，否则影响试验结果；配制PBS 液所用试剂磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钾等4 种试剂构成稳定的缓冲体系，确保试验结果的稳定呈现，一般不宜用生理盐水等代替[8]；对投入试验的所用器械、PBS 液等要严格消毒，防止污染；在进行抗原效价测定时，应该做3 个重复，取至少2 个测定结果一致的数值作为抗原效价测定值；待检样品对倍稀释要规范，判定方法是：同一待检样品对倍稀释后，颜色逐步变淡，均匀过渡，否则可能是漏加或重复加样造成。