黎国锦

(师宗县畜牧局，云南 师宗 655700)

试验以稀释液营养剂和抗菌素对常温保存奶山羊精液品质的效果试验。共设有5个稀释液配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号稀释液配方是筛选理想营养剂而设计的，分别以葡萄糖、柠檬酸钠等混合物为营养剂。在该试验中，主要测定了用不同稀释液稀释的奶山羊精液在保存不同时间后精子活力、存活率、顶端完整率和畸形率等指标，筛选理想的奶山羊精液常温保存的稀释液配方。

1 材料和方法

1.1 试验时间和地点

2010年3～5月，在云南省石林梦达尔羊场进行。

1.2 试验动物的选择

试验选用发育正常，性机能良好，生殖机能正常的萨能、关中奶山羊。在试验期间，分别隔离饲养。

1.3 稀释液的成分及配制

1.3.1 稀释液配方 见表1。

表1 稀释液的配方

1.3.2 稀释液配制

把准确称量的各种成分放在消毒过的干燥容器内，按比例加入双重蒸馏水溶解，如果不易溶解可适当加温溶解;对溶解后的溶剂用滤纸过滤，以去掉杂质，加温的溶剂需待冷却后再进行过滤;把过滤后的溶剂密封后进行消毒，可以蒸煮消毒，也可以高压消毒;加入抗生素;搅拌混匀稀释液，将稀释液充分混匀。

1.4 精液的采集及稀释

一般采精最佳时间是在每天上午8:00用假阴道采精一次，将采得精液分装，然后对精液分别进行常规检查，原精活力达0.7以上，pH值在6.4～6.8，色、味正常，精子密度每毫升在15亿以上的为合格，并将合格精液做好标记。

将分装好做好标记的精液与配好的稀释液分别放在一定温度的水浴锅中，待两者温度相同时，将各组稀释液分别沿试管壁缓慢加入精液中，边加边轻轻摇动，让精液与稀释液混合，稀释比例为1∶2 ～1∶10。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 精子活力的测定

采用平板压片法。将显微镜置于38～40℃的保温箱中，放大400倍，进行镜检，按十级制进行评分。每个样品三次重复评定。取其平均数。

1.5.2 精子存活率测定

用刚果红－苯胺兰对精子染色。

(1)染色溶液:1%刚果红染液(溶液为7%葡萄糖溶液)，5%苯胺兰染液(溶液为2.9%柠檬酸钠溶液)。

(2)具体方法:每个精液样品制两张抹片、风干。立即置于1 000～1 600倍显微镜下用油镜观察200～600个精子。计算有受精潜力数占所有计数的百分率。

(3)评定方法:根据精子着色、顶体完整、畸形等情况，将精子分为两类。

有受精潜力的精子:整个精子不着色，形态正常且顶体完整。

无受精潜力的精子:精子着红色(包括精子的任何一个部位着色)，不着色的精子但畸形或顶体不完整。

1.5.3 精子顶体完整率和畸形率的观察

(1)实验用的染液:姬姆萨染液。

姬姆萨染液是由姬姆萨原液和磷酸缓冲液及蒸馏水配制而成，比例为2∶3∶5，配好立即使用，久置染色效果减退。

(2)其它材料:显微镜(1 000倍油镜)、血球计数器、载玻片、盖玻片、滴管。

(3)方法:取精液1滴，滴入含有2滴姬姆萨染液的小瓶中(青霉素瓶)，轻轻摇匀后，从中取出1滴染色的精液滴在清洁的载玻片中央，盖上盖玻片即成。同一精样制作两张片子，在显微镜下观察精子的顶体。

1.5.4 pH值的测定

用试纸或(pHs－2)酸度计测出不同稀释液稀释的奶山羊精液保存不同时间后的pH值。

1.5.5 数据处理

试验数据采用方差分析进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 精子活力的变化

用Ⅲ号稀释液配方稀释的奶山羊精液保存12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h 后精子活力均高于 Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ号稀释液配方稀释的奶山羊精液。见表1。

表1 不同稀释液稀释后精子活力的变化

将不同稀释液稀释的奶山羊精液保存48h后精子活力进行多重比较，结果见表2。

表2 不同稀释液稀释后精子活力比较

由表2可知:Ⅲ号稀释液配方优于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ号稀释液配方。Ⅴ号稀释液配方优于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ。

2.2 精子存活率的变化

用Ⅲ号稀释液配方稀释的奶山羊精液保存24h、48h、60h、72h后精子存活率均高于用Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ号稀释液配方稀释的奶山羊精液的精子存活率。见表3和图1。

表3 不同稀释液稀释后精子存活率变化 %

将不同稀释液稀释的奶山羊精液保存48h后精子存活率进行多重比较，结果见表4。

表4 保存48h后精子存活率的多重比较

由表4可知:Ⅲ号稀释液配方优于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ号稀释液配方处理，且差异显著(P＜0.05);但在Ⅳ、Ⅴ号配方处理的稀释液之间进行相互比较，差异不显著(P＞0.05)。

2.3 顶体完整率和畸形率的测定结果

用Ⅲ号稀释液配方稀释的奶山羊精液保存24h、48h、72h后，精子顶体完整率和畸形率的测定结果均优于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ号稀释液配方稀释的奶山羊精液的精子顶体完整率和畸形率。结果见表5。

表5 不同稀释液稀释后精子顶体完整率和畸形率的变化%

由表5可知:以任何一种稀释液稀释奶山羊精液，其精子顶体完整率均下降，畸形率均上升，但他们的变化情况不同。

2.4 pH值的测定

将用不同稀释液配方稀释的奶山羊精液在保存24 h、48 h、72 h后的精液pH值进行比较。结果见表6和图2。

表6 不同稀释液配方稀释后精液pH值的变化

图2 pH值的变化

由表5可知:不同稀释液稀释的奶山羊精液pH值均有先上升后下降的趋势，上升和下降幅度不同。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号稀释的精液pH值间进行比较，Ⅲ号稀释液配方稀释的精液pH值变化幅度最小，但差异不显著;Ⅳ、Ⅴ号稀释液配方稀释的精液pH值间进行比较，Ⅳ号稀释液配方稀释的精液pH值变化幅度较大，差异极显著(P＜0.01)。

3 结论

(1)由表1可知:Ⅲ号稀释液配方稀释的奶山羊精液保存 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h 后精子活力均高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ号稀释液配方稀释的奶山羊精液。表2可知:保存48 h后对精子活力进行多重比较，Ⅲ号稀释液配方优于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ号稀释液配方。由表3可知:Ⅲ号稀释液配方稀释的奶山羊精液保存24 h、48 h、72 h后精子存活率均高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ号。由表5可知:Ⅲ号稀释液配方稀释的奶山羊精液保存24 h、48 h、72 h后的精子顶体完整率和畸形率的测定结果均优于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ号稀释液配方稀释的奶山羊精液的精子顶体完整率和畸形率。由表6和图2可知:用5种稀释液配方稀释的奶山羊精液保存24 h、48 h、72 h后的精液pH值进行比较，不同稀释液稀释的奶山羊精液pH值均有先上升后下降的趋势，上升和下降幅度不同，Ⅲ稀释液配方稀释的精液pH值变化幅度最小。经过试验比较精子活力、顶体完整率和畸形率、pH值的变化，可以看出Ⅲ号稀释液是最佳的稀释配方。在奶山羊人工授精生产中，建议使用Ⅲ号稀释液配方稀释的保存48 h的奶山羊精液。

(2)不同的稀释液营养剂和抗菌素对常温保存奶山羊精液品质之间存在差异。