糜长浩，邹文斌，于海亮，王晓慧，黄施杰，张跟喜，戴国俊*，张 涛，谢恺舟，施会强，王金玉

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225000；2.江苏京海禽业集团有限公司，江苏南通 226100）

鸡人工授精技术的广泛应用提高了种公鸡的利用率，促进了家禽业集约化和规模化发展，然而人工授精技术优越性的实现主要依赖于精液稀释液的品质[1]。精液中添加稀释液不仅能延长精液的保存时间并扩大精液剂量，还可以为精子提供良好的生存环境，维持渗透压和电解质平衡，保护精子细胞膜的完整，降低精液的畸形率[2]。新鲜的精液原液经过稀释液稀释后，能够提高种蛋受精率和母鸡的受精效率，减少种公鸡的饲养成本[3]。因此，开展鸡精液稀释液系统研究对家禽业繁殖和生产具有重要意义。

海扬黄鸡是经国家遗传资源委审定的优质肉鸡新品种（配套系），具有全方面疾病净化、整齐度高、抗病力强、胸肌率高、腹脂率少的特点[4]。先前关于鸡精液稀释液的研究较多，不同稀释液的效果不尽一致[5]。本研究以海扬黄鸡为实验材料，对3 种不同的精液稀释液（基础稀释液、BPSE 稀释液、自配稀释液）稀释后在体外存放不同时间以及2 种处理的自配稀释液存放不同天数稀释后的精液品质相关指标进行测定比较，以期探讨适合海扬黄鸡的精液稀释液配方，旨在为海扬黄鸡的人工授精技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与仪器 选取海扬黄鸡配套系亲本FF 系50 只种公鸡作为实验动物。EPED-10DJ 型实验室超纯水机购自南京易普易达科技发展有限公司；电子天平购自塞多利斯科学仪器（北京）有限公司；蒸汽灭菌器购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；离心机购自爱普拜斯应用生物系统贸易（上海）有限公司；奥林巴斯CX31 生物显微镜购自北京佳源兴业科技有限公司；恒温水浴锅购自上海雷韵试验仪器制造有限公司；集精杯、载玻片、盖玻片、移液枪、血球计数板等。

1.2 实验设计及饲养管理 实验用种公鸡每2 d 进行1次采精训练，采精方式为背腹式按摩法[6]，于适应性训练后的第8 天早上喂料前，采集50 只空腹公鸡的精液，其中30 只公鸡随机分成5 组，每组6 只，将每组公鸡的精液均匀混合后等量分为3 份，分别用3 种稀释液（配方见表1，自配稀释液数据没有公开），按1:2 比例进行稀释，采用单因子完全随机区组试验设计方法进行试验，区组为5 个不同的组，比较3 种稀释液稀释后0.5和1.5 h 的精液品质，从而选出最优稀释液。不同灭菌方式和不同稀释液存放时间的分析采用2×2 析因试验设计，灭菌方式的2 个水平分别为100℃和双抗（青霉素和链霉素），稀释液存放时间的2 个水平分别为3 d 和6 d，4℃冰箱存放，将其余20 只公鸡精液随机分为4 组，用最优稀释液按1:2 稀释后，随机安排到4 个水平组合处理数中，每个处理重复数为5。

表1 精液稀释液的配方

1.3 测定指标及方法

1.3.1 精子活力 用滴管吸取稀释后的精液，滴在载玻片，用显微镜观察并计算显微镜一个视野中直线运动的精子个数。精子活力=直线运动精子数/视野中精子数×100%。

1.3.2 精子活率 采用伊红-苯胺黑活体染色技术染色法测定精子活率，即将5% 伊红1% 苯胺黑染液以1:4体积混匀，3 μL 精液加入100 μL 混合染液的EP 管混匀，取10 μL 染色液-精液混合液涂片，均匀地涂抹在载玻片上，自然风干后，400 倍光学显微镜视野下计数300个精子，统计所含的活精子数所占比例[7]。

1.3.3 精子畸形率 取20 μL 精液加入180 μL 0.9% 的氯化钠稀释混匀，取20 μL 精液混合液制备精液涂片，用姬姆萨染色法染色，每张抹片观察50 个精子，计数其中的畸形精子[8]，精子畸形的判断标准参考文献[9]。精子畸形率=所数精子中畸形精子总数/500×100%。

1.3.4 精液死精率 使用移液枪吸取15 μL 稀释液到载玻片上，用盖玻片盖住制成抹片，然后放置于显微镜400 倍视野下进行观察。分别观察5 个视野中的精子情况，数出视野中不动的精子，并数出每个视野中的精子总数，每个视野中精子数不少于200 个。精液死精率=所数精子中不动的精子数/所数的总精子数×100%。

1.3.5 精子密度 使用血细胞计数器计数，方法参考文献[10]。有效精子数=精液量×精子密度×精子活率。

1.4 统计分析 所有实验数据均采用Excel 整理，不同稀释液间测定指标的差异显著性比较采用两因子方差分析，统计分析模型为：y=μ+α+β+e，其中μ为总体均数，α为不同稀释液的效应，β为区组效应，e为误差效应；不同灭菌方式和不同稀释液存放天数对所测精液品质指标也采用两因子方差分析，统计分析模型同前，α为不同灭菌方式的效应，β为稀释液不同存放时间的效应。多重比较均采用LSD 法。所有数据统计分析均在SPSS25.0 统计软件上运行。

2 结果与分析

2.1 不同精液稀释液稀释后体外存放时间不同对精液品质影响 由表2 可见，存放0.5 h 后，自配稀释液稀释后的精子活力较BPSE 稀释液提高了2.29%（P＜0.05），与基础稀释液无显著差异；自配稀释液稀释后的精子活率最高，较基础稀释液、BPSE 稀释液分别提高0.65%（P＜0.05）、0.66%（P＜0.05），基础稀释液和BPSE稀释液稀释的精液活率无显著差异；基础稀释液畸形率最低，BPSE 稀释液稀释的精子畸形率最高，分别比基础稀释液、自配稀释液提高7.5%（P＜0.05）、3.14%（P＜0.05）。存放1.5 h 后自配稀释液稀释后的精子活力和精子活率均为最高，精子活力与BPSE 稀释液无显著差异，较基础稀释液提高4.61%（P＜0.05），精子活率较基础稀释液和BPSE 稀释液分别提高0.98%（P＜0.05）、1.12%（P＜0.05）；自配稀释液稀释的精子畸形率最低，BPSE 稀释液稀释的精子畸形率最高，较基础稀释液、自配稀释液分别提高7.96%（P＜0.05）、10.42%（P＜0.05）；3 种稀释液稀释的精液在体外存放0.5 h 和1.5 h 之后，精液死精率均无显著差异，但在1.5 h时自配稀释液死精率最低。

2.2 2 种处理的自配稀释液存放不同天数稀释后精液品质分析 由表3 可见，经2 种不同处理的自配精液稀释液稀释并存放3 d 和6 d 之后精液品质的各相关指标均无显著差异。

3 讨 论

3.1 不同精液稀释液稀释后在体外存放不同时间对精液品质的影响 精液品质直接关系到受精率的高低[11]，而良好的精液品质又与稀释液物质组成有着密切的关系[12]。有研究发现，鸡精液稀释后精子的运动度、ATP 交换、气体交换和离子平衡等都会受到稀释液成分的影响，特别是稀释比例较高时[13]。李洁等[14]研究发现，在精液稀释液中添加适宜浓度的N-乙酰半胱氨酸可以显著提高精子生存指数以及延长精子的生存时间。赵万乐等[15]研究表明，在精液稀释液当中添加适量的L-半胱氨酸可以明显延长精子寿命。本实验结果显示，自配稀释液稀释的精子活率和精子活力显著高于BPSE 稀释液和基础稀释液，3 种稀释液的精子死精率没有显著差异，但在1.5 h 时自配稀释液的死精率最低，BPSE 稀释液稀释后的精子畸形率在存放0.5 h 和1.5 h 后均为最高。因此自配稀释液稀释后的精液品质要优于其他2 种稀释液。这可能是因为自配稀释液中加入了适量的果糖和谷氨酸钠，谷氨酸钠具有延长精子寿命的作用[16]。稀释液中的糖类可以有效保护精子质膜的完整性[17]，对稳定精子的形态完整具有良好作用，且果糖的效果要好于葡萄糖[18]。此外，自配稀释液中还有磷酸二氢钾和磷酸二钾氢2 种缓冲物质，它们能够保证精液具有适宜的pH，以利于精子存活[19]。

3.2 2 种处理的自配稀释液存放不同天数对精液品质的影响 陶剑等[20]研究发现，精液采用3 种不同稀释液稀释后在室温保存3 d 仍能满足人工授精的精子活力的要求。周小枫等[21]研究发现，储存2 个月的精液稀释液的孵化率与现配现用的精液稀释液没有显著差异。本试验中，经煮沸灭菌和加入双抗的自配精液稀释液存放3 d 和6 d 之后精液品质的各相关指标均无显著差异。

4 结 论

自配稀释液稀释后精液品质优于BPSE 稀释液和基础稀释液，有充足的营养和保护精子的物质，同时具有一定的缓冲能力，可以考虑作为海扬黄鸡的精液稀释液；经过煮沸灭菌或加入双抗处理的自配精液稀释液保存6 d之内对所测精液品质指标没有影响。