焦雨帆， 刘飞萍，2， 傅夏燕， 陈其臻， 纪亚忠， 王炎秋

(1. 同济大学附属同济医院生殖医学中心，上海 200065； 2. 上海市嘉定区妇幼保健院，上海 201821)

冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)技术因其具有提高累积妊娠率、降低卵巢过度刺激综合征发生率、增加子宫内膜容受性等优点，已成为人类辅助生殖技术的重要组成部分。FET的成功与否与多种因素有关，如年龄、胚胎质量、子宫内膜容受性等，而子宫内膜的准备是其中关键环节，目前最佳子宫内膜准备方案尚无共识。国内外已将多种子宫内膜准备方案应用于临床，分别为自然周期(natural cycle, NC)方案，激素替代周期(hormone replacement cycle, HRT)方案以及促性腺激素释放激素激动剂联合激素替代周期(gonadotropin releasing hormone agonist plus hormone replacement cycle, GnRHa+HRT)方案。本研究通过比较以上3种内膜准备方案，探讨何种方案可使FET的患者取得更好的妊娠结局，以期为临床工作提供参考意见。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2016年7月1日—2018年12月31日至同济大学附属同济医院生殖医学中心行卵裂期胚胎FET的患者资料，进行回顾性分析。纳入标准: 年龄25～34岁；移植2枚胚胎，其中至少移植1枚优质胚胎；行FET操作；不孕类型为原发不孕或继发不孕；无严重器质性或免疫性疾病者。排除标准: 存在严重子宫畸形；黏膜下子宫肌瘤或肌瘤较大严重影响子宫腔形态；子宫腺肌症(Ⅳ期)；子宫内膜增生、息肉；冻融周期行囊胚移植者；输卵管积液；免疫因素流产患者；双方或者其中一方存在染色体异常者；多囊卵巢综合征患者，资料不全者。

1.2 方法

回顾性分析2016年7月1日—2018年12月31日在同济大学附属同济医院生殖医学中心进行的605个FET周期患者的临床资料及胚胎实验室数据。入选标准为NC、HRT或GnRha+HRT周期。所有纳入研究的患者胚胎冷冻均采用玻璃化冷冻技术，移植前行宫腔镜检查排除子宫内膜病变、宫腔粘连等。胚胎移植后12 d测血β-hCG以判断生化妊娠；妊娠者则于移植后30～35 d行阴道超声检查以明确孕囊位置、孕囊个数、心管搏动，及是否为异位妊娠；随访并记录患者持续妊娠情况、分娩及新生儿情况。

1.2.1 超声测量方法 采用三维能量多普勒超声显像仪(美国GE公司，Voluson E10型)，对所有患者均由同一医师在内膜转化日行经阴道超声监测，采用仪器内预定义设置的能量多普勒值对子宫内膜进行120°慢扫: 屏幕显示最完整的子宫内膜线时测量内膜厚度。应用多平面成像模型描记子宫内膜轨迹，按照30°旋转切面，手动描记子宫内膜切面轨迹，通过计算机辅助分析成像程序(virtual organ computer-aided analysis, VOCAL)自动生成子宫内膜容积。于子宫颈、体部两侧探查，显示子宫动脉清晰、规则的脉冲多普勒血流频谱，观察并测定子宫动脉PI、RI、S/D值，每项指标测量3次，取其平均值。

1.2.2 自然周期 在月经周期第12天左右开始行B超监测卵泡，同时测定外周血中女性激素，评估卵泡及内膜发育情况，确定排卵时间，排卵后口服地屈孕酮片(商品名称: 达芙通)30 mg/d。当B超提示内膜厚度(endometrial thickness, Em)≥8 mm、卵泡直径为18～20 mm，且雌二醇(estradiol, E2)≥650 pmol/L，于排卵后3 d行卵裂期胚胎移植。

1.2.3 激素替代周期 在月经周期第2～5天起口服戊酸雌二醇(商品名称: 补佳乐)2～4 mg/d或芬吗通(17-β雌二醇片)红片2～4 mg/d，每隔3～5 d予B超监测内膜厚度。当Em≥8 mm，E2水平≥650 pmol/L且孕酮(P)<5.0 nmol/L时加用孕激素转化内膜，予以黄体酮针20～40 mg/d肌内注射或雪诺酮90 mg/d阴道内给药，并口服地屈孕酮片30 mg/d。

1.2.4 促性腺激素释放激素激动剂联合激素替代周期 对于排卵者于排卵后3～5 d后行垂体降调，并给予黄体酮类药物协助内膜转化；对于无排卵或卵泡不破裂黄素化者，予人工周期，同时监测内膜变化，在使用黄体酮类药物转化内膜的第3～5天予降调。使用贝依(通用名称为注射用醋酸亮丙瑞林微球，3.75 mg/支，长效GnRHa)，皮下注射，降调成功后予激素替代方案，黄体支持同HRT周期。

1.3 观察指标

(1) 3组不同周期患者基本资料: 年龄、不孕年限、不孕类型、体质量指数(BMI)、移植冻胚级别等；(2) 在内膜转化日行阴道三维超声测量子宫内膜厚度、子宫内膜容积、子宫动脉PI、RI、S/D值；(3) 临床妊娠结局: 临床妊娠率、活产率、早产率、足月产率、早期流产率、晚期流产率、异位妊娠率等。

1.4 妊娠结局

临床妊娠指冻胚移植后5周超声扫描见孕囊回声和原始心管搏动。早产定义为妊娠满28周至不满37周间分娩；足月产定义为妊娠满37周至不满42周间分娩。早期流产指妊娠12周前妊娠终止，晚期流产为妊娠12周至不满28周间妊娠终止。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 不同子宫内膜准备方案下研究对象基本情况的比较

NC组共纳入145个周期，HRT组共纳入378个周期，GnRHa+HRT组共纳入82个周期，3组子宫内膜准备方案年龄、不孕年限、不孕类型、BMI、移植冻胚级别比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3种子宫内膜准备方案下研究对象基本情况的比较

2.2 不同内膜准备方案患者内膜转化日三维超声各测量指标情况

3种子宫内膜准备方案下内膜转化日子宫内膜厚度: HRT组为(8.48±1.72) mm，GnRHa+HRT组为(8.27±2.02) mm，NC组为(9.93±1.78) mm，NC组内膜厚度高于HRT组及GnRHa+HRT组，3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；子宫内膜容积: HRT组为(2.61±0.30)cm3，GnRHa+HRT组为(2.04±0.04) cm3，NC组为(2.96±0.04) cm3，GnRHa+HRT组子宫内膜容积低于HRT组及NC组，3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。3组患者中子宫动脉血流参数情况差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 3种内膜准备方案患者内膜转化日三维超声各测量指标的比较

2.3 不同内膜准备方案下妊娠结局的比较

3组患者足月产率比较，HRT组为57.1%(88/154)；GnRHa+HRT组为58.3%(21/36)；NC组为75.3%(55/73)；自然周期(NC)组的足月产率明显高于HRT组及GnRHa+HRT组，3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；组内HRT组与NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。而3组患者临床妊娠率、活产率、早产率、早期流产率、晚期流产率、异位妊娠率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 3种内膜准备方案下妊娠结局的比较

2.4 冻融胚胎移植患者足月产的影响因素分析

以冻融胚胎移植患者足月产妊娠结局为因变量，单因素Logisitic回归分析表明，不孕类型、双胎妊娠及内膜调理方案3项指标对冻融胚胎移植患者是否足月产的影响均有统计学意义(P<0.05)，见表4；进一步多因素Logistic回归分析结果表明，不孕类型、双胎妊娠及内膜调理方案为冻融胚胎移植患者是否足月产的独立影响因素(P<0.05)，其中内膜调理方案中以NC为参考，HRT及GnRHa+HRT两种方案冻融胚胎移植患者足月产的可能性均降低，其OR值及95%CI分别为0.452(0.239～0.853)、0.415(0.173～0.995)，见图1。

表4 影响冻融胚胎移植患者足月产的单因素logistic回归分析

图1 影响冻融胚胎移植患者足月产的多因素Logistic回归分析Fig.1 Multivariate analysis of factors associated with full-term deliveries

3 讨 论

目前IVF-ET治疗已成为不孕症患者最有效的治疗方式。相较于鲜胚移植，冻融胚胎移植可显著降低卵巢过度刺激综合征的发生[1]，并可于FET前行充分的内膜准备以降低子宫内膜及子宫环境的不利影响因素，提高其移植效率。随着胚胎的玻璃化冷冻保存技术的成熟，其胚胎质量和发育潜能与新鲜胚胎相接近[2]，故FET已经成为辅助生殖助孕过程中的一种常规技术。

3.1 不同子宫内膜准备方案的优劣性对比

本研究纳入了进行NC组、HRT组、GnRHa+HRT组3种内膜准备方案的605个周期。NC较为接近生理状态，因为有自然排卵后的黄体形成。HRT周期则需在移植后予甾体激素行黄体支持。GnRHa+HRT周期适用于盆腔子宫内膜异位症或子宫腺肌症合并不孕症的患者以及反复着床失败的患者。促性腺激素释放激素激动剂通过与GnRH竞争性结合垂体前叶促性腺激素分泌细胞上的受体，导致垂体不再释放促性腺激素，实现垂体的降调，从而抑制内源促性腺激素的释放，有利于改善子宫内膜容受性，调节免疫活性作用，改善胚胎着床。

3.2 不同内膜准备方案患者子宫内膜厚度、内膜容积及子宫动脉血流参数情况

本研究发现，在FET周期中临床妊娠组内膜转化日子宫内膜厚度为(8.86±1.97) mm，大于未临床妊娠组[(8.32±1.59) mm]，差异有统计学意义(P<0.001)。故认为内膜厚度与临床结局呈正相关，与大多数的文献报道结果一致。一项纳入3 601名不孕妇女IVF-ET周期的多中心回顾性研究发现，HCG日的内膜厚度影响IVF-ET的妊娠结局，当内膜厚度<8 mm时临床妊娠率与活产率较低[3]。Groenewoud等[4]认为在FET周期中内膜厚度尚不能预测其妊娠结局。Yuan等[5]的一项大数据研究中，共研究了10 000多个IVF/ICSI新鲜周期，结果发现，子宫内膜厚度小于8 mm的患者临床妊娠率明显低于子宫内膜厚度在8～11 mm的患者(分别为23%和37.2%)。

子宫内膜容受性(endometrial receptivity, ER)是指内膜允许囊胚定位，黏附，侵入，并诱导内膜间质发生一系列变化，最终使胚胎着床。反映ER的指标主要有子宫内膜厚度、子宫内膜容积、子宫内膜或子宫动脉多普勒数据及CD4+、CD8+、CD14+等分子标志物[6]。子宫内膜容积反映了整个宫腔子宫内膜的情况，内膜厚度与内膜容积具有显著相关性。本研究中，黄体转化日子宫内膜容积: HRT组为(2.61±0.30)cm3，GnRHa+HRT组为(2.04±0.04)cm3，NC组为(2.96±0.04)cm3，3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，与3组内膜厚度差异相一致。Mayer等[7]在一项回顾性队列研究中发现，妊娠组与未妊娠组子宫内膜容积存在显着差异，妊娠率随子宫内膜容积增大而升高，与本研究结果一致。

子宫内膜及内膜下血流灌注的缺失往往伴随着子宫动脉的高阻状态[8]。本研究中3组内膜准备方案患者内膜转化日子宫动脉血流参数无明显差异性，临床妊娠率亦无显著性差异。一项研究在胚胎移植当天评估了70名女性，发现临床妊娠和未妊娠女性之间子宫动脉PI和RI以及子宫内膜下PI和RI相似[9]。但有学者认为子宫动脉阻力可以反映ER并影响妊娠结局，该研究显示胚胎移植日子宫动脉高PI、RI与不良妊娠结局有关，而子宫内膜血流PI、RI相较于子宫动脉降低[10]。尽管子宫动脉高阻力常与不良妊娠结局有关，但其并不能直接反映内膜血供，对于妊娠结局的影响仍需进一步分析探讨[6]。作为一种非侵入性检查，经阴道三维超声测量子宫内膜容积、子宫内膜血流参数、子宫动脉血流参数可预测子宫内膜容受性，可以指导临床医师进行FET胚胎移植时机的选择。

3.3 不同子宫内膜准备方案对妊娠结局的影响

揭慧英等[11]的研究发现，NC周期、HRT周期两种内膜准备方案的胚胎着床率及临床妊娠率无明显差异。一项2016年的Meta分析结果显示，NC周期患者的临床妊娠率明显高于HRT周期，推测HRT周期临床妊娠率的降低可能与治疗过程中子宫内膜容受性受损以及胚胎种植窗的提前关闭有关[12]。Kalem等[13]的研究同样证实，NC周期、HRT周期的着床率、临床妊娠率及活产率并无差别。本研究根据患者内膜特征，选择不同的内膜处理方案，3组均获得了较满意的临床结局。

3.4 冻融胚胎移植患者足月产的影响因素分析

本研究结果表明，不同的内膜调理方案、双胎妊娠及不孕类型为足月产的独立影响因素。相比于HRT及GnRHa周期患者，NC周期患者足月产率显著增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。原发不孕的FET患者足月产率较继发者高2.170倍(OR=2.170,95%CI: 1.270～3.709)。单胎妊娠患者足月产率较双胎妊娠患者高2.103倍(OR=2.103,95%CI: 1.132～3.907)。

双胎妊娠为高危妊娠，易发生各种妊娠期并发症，如早产、胎儿窘迫、产后出血等。早产是双胎妊娠最常见的并发症之一[14]。本研究发现，对于年龄<35岁的不孕患者，单胎妊娠足月产的可能性为双胎妊娠的2.103倍(OR=2.103,95%CI=1.132～3.907)。建议对35岁以下年轻患者行单胚移植，以求更好的围产期结局。

本研究发现，原发不孕患者足月产率为继发性不孕患者的2.170倍(OR=2.170,95%CI=1.270～3.709)。故推测，继发不孕为足月产危险因素，可能既往妊娠尤其流产等导致子宫内膜的损伤，从而导致胎盘形成不良、宫颈机能不全等，但具体机制需进一步探究[15-16]。

NC方案中，子宫内膜发育为机体生理状态下，通过自身内源性激素调控。本研究发现，相比于HRT及GnRHa+HRT方案，NC组患者具有更高的足月产率。因此，对于有自然排卵的患者尽可能选用NC方案，可能获得更好的妊娠结局。

综上所述，本研究通过回顾性分析单中心的3种不同的子宫内膜处理方案，对临床妊娠结局的影响，结果显示3组早产率、早期自然流产率、晚期流产率、异位妊娠率等妊娠结局，差异均无统计学意义，而足月产率3组比较，差异有统计学意义。具体机制尚待扩大样本量，设计多中心的随机对照试验和系统性评价，进行深入分析。