谢惠康, 张莉萍, 董正伟, 侯立坤, 黄 焰, 武春燕

(同济大学附属上海市肺科医院病理科，上海 200433)

早期肺腺癌，临床上主要以磨玻璃结节为影像学表现，该部分病变主要以外科手术切除为主，其病理诊断横跨原位腺癌、微浸润性腺癌、浸润性腺癌。有研究证实，无论是原位腺癌还是微浸润性腺癌，其亚叶切术后5年总生存率及无复发生存率均达到100%，因此病理医师有必要在术中冰冻检查时便对病变进行具体诊断，帮助临床确认合理手术方式，使患者利益最大化。但至目前为止国内各医院开展冰冻切片病理诊断早期肺腺癌报告模式差异巨大，部分医院因以下原因尚难在术中冰冻阶段对病变给出合适诊断: (1) 早期国外术中冰冻组织学亚型研究显示诊断一致率低[1]；(2) 迄今为止仍有部分肺癌诊治指南不推荐在术中冰冻明确原位腺癌、微浸润性腺癌诊断[2]；(3) 同行间诊断风格及尺度存在差异，较难形成统一意见，切片会诊后容易造成分歧；(4) 担心术中冰冻诊断不足导致术后升级，患者需接受二次手术而造成不必要纠纷。但实际上随着近几年磨玻璃结节手术数量的增多以及术中冰冻诊断经验的积累，一些新近研究显示早期肺腺癌冰冻与组织学诊断一致率可以达到一个较高水平[3-4]；其次随着国内病理学界越来越意识到该问题的重要性，2019年由胸部病理学组出面制定了《早期(非黏液型附壁生长方式)肺腺癌冰冻切片病理诊断专家共识》，强调了术中冰冻诊断应酌情明确原位腺癌、微浸润性腺癌、浸润性腺癌，并给出了相应的诊断规范，以期统一各家单位之间的诊断标准[5]。实际工作中病理医师最为担心的是术中冰冻诊断不足致术后升级，造成胸外科医师和患者的不理解，故倾向于术中不对原位腺癌、微浸润性腺癌进行明确诊断，或诊断偏重，反而造成了患者手术范围不必要的扩大。肺科医院作为专科医院，日常面对大量相应诊断问题，自2011年多学科分类颁布之后，经过一段时间磨合与调整，医院于2013年正式在术中冰冻中采用新诊断模式和标准。通过平时工作中大量实际操作和演练，以及对于国内外相关文献复习和自身经验积累，总结发现早期肺腺癌的冰冻诊断除有赖于病理医师诊断标准掌握外，还涉及包括诊断医师、冰冻技术员共同参与的取材、制片、影像学参考、冰冻诊断等各个环节。所以想要获得较高的术中术后诊断一致率，需要一整套涵盖所有环节的标准化流程。在此将制订的流程分享，以期帮助国内同道更好地熟悉和掌握早期肺腺癌术中冰冻诊断，减少错漏风险发生。

1 术中冰冻诊断术后升级的高危因素及原因

术中冰冻与术后诊断总体一致率较高，但仍有部分术中诊断为原位腺癌和微浸润性腺癌的腺癌术后上升为浸润性腺癌，亚肺叶切除会造成潜在切除不足[3-4]。本研究团队复习了现有一些肺癌术中冰冻与术后诊断一致性研究[1,3-11]，结合平时的工作经验，将文献中提及的不一致原因罗列如下: 冰冻取材块数不足、冰冻切片层数不足、明显间质硬化、纤维化(图1A、B)及炎症反应(包括肺泡腔内渗出组织细胞、泡沫细胞)的存在造成判断有无浸润困难(图1C、D)、肿瘤靠近脏层胸膜难以评估胸膜侵袭情况、贴壁型腺癌肿瘤细胞缺乏异型性导致肿瘤与反应性增生难以鉴别、冰冻切片质量不佳、术中术后由不同医师诊断(诊断标准不一致)。根据上述原因进行了一下简单的归纳，发现所有造成术中术后诊断不一致的原因可以归结为以下3类: (1) 冰冻切片制片质量欠佳；(2) 术中冰冻诊断不足；(3) 冰冻标本取样不足，见图2。

图1 形态不典型及制片欠缺Tab.1 Atypical histologic appearance and poor slice preparationA: 冰冻切片200倍，肿瘤间质增生硬化，肺泡结构塌陷，使得难以鉴别是否存在间质浸润;B: 冰冻切片100倍，大量的纤维化组织，使得难以鉴别是否存在间质浸润;C: 冰冻切片100倍，间质内大量淋巴细胞及炎细胞浸润，使得难以评估上皮细胞为反应性增生还是存在间质浸润；D: 冰冻切片100倍，肺泡腔内大量存在的组织细胞，既有可能被误认为肿瘤细胞，也有可能遮盖住原有的肿瘤细胞及结构造成误诊；E: 冰冻切片不完整；F: 冰冻切片存在明显皱褶；G: 冰冻切片存在明显刀痕；H: 冰冻切片100倍，切片内组织收缩过于明显，使得难以鉴别是否存在肿瘤性病变;I: 显微镜目镜视场为20，显微镜物镜倍数为4倍

图2 术后升级原因Fig.2 Reasons for postoperative diagnosis upgrade

1.1 冰冻切片制片质量欠佳

冰冻切片制片质量欠佳主要包括: 切片过厚、不完整(图1E)、皱褶(图1F)、挤压及刀痕(图1G)，染色不佳，细胞过肿胀或过收缩(图1H)、组织结构不清晰，封片树胶未完全覆盖组织，有气泡产生。

1.2 冰冻诊断不足的原因

原因主要包括(病变)客观因素和(诊断者)主观因素，客观因素又可以进一步细分为病变形态不典型造成的诊断困难: 炎症反应(包括肺泡腔内渗出组织细胞、泡沫细胞)、明显的间质硬化、肿瘤靠近脏层胸膜难以评估胸膜侵袭情况、贴壁型腺癌肿瘤细胞缺乏异型性导致肿瘤与反应性增生难以鉴别；以及手术及制片因素造成的病变形态不典型: 手术及取材过程中会对肺组织造成挤压，组织细胞形态发生改变。主观因素则是因诊断者诊断标准不明确、不统一(如术中术后由不同医师诊断)造成的诊断不一致。

1.3 冰冻标本取样不足

原因主要包括冰冻切面数层数不足(冰冻组织石蜡包埋深切后浸润范围大于原冰冻切片)及冰冻取材不足(另取石蜡组织内浸润范围大于冰冻取材组织)，取材不足的原因再行细分则可分为取材质量不足(取材不具代表性，未取到病变典型部位)和取材数量不足(肿瘤体积及异质性大，少量的抽样无法反应病变完整的真实情况)。

在本研究中术中与术后诊断不符最大的因素是取样不足(尤其是取材不足)、其次分别为冰冻诊断不足和制片不足。其中唯一的高危因素是病变直径，当病变直径>1 cm时，病变发生术后升级的概率上升，在此时诊断原位腺癌及微浸润性腺癌需小心谨慎[4]。

2 如何尽量避免术中冰冻诊断术后升级

术中冰冻术后诊断意外升级是一个不可避免的问题，但通过一定总结，可以找出引起该问题高危因素及具体升级原因。针对造成升级原因，在实际操作中尽量避免相应错误发生，可达到减少术后诊断升级的目的。

2.1 如何保证冰冻切片制片质量

技术员的标准化流程操作是保证一张切片质量的关键所在，有文献认为冰冻切片质量在于对切片组织的固定质量，故要求每张切片均应固定1 min以上[7]。在日常工作中发现即便是达到了要求的固定时间，部分切片质量仍达不到一个很好的诊断要求。本团队认为制片不足的另一重要原因是由冰冻切片后固定时机(组织切片后放置于空气中到滴加固定液的时间)把握不佳造成的细胞过分肿胀或收缩造成，这可能是由于每块组织在冰冻切片机内冷冻的时间和程度不一致造成的。由于固定时机较难把握，故切2张切片有利于在2张切片中平衡固定时机，保证其中至少1张的切片质量(当1张切片过肿胀时另1张不至于过收缩，或1张切片过收缩时另1张不至于过肿胀)。在此基础上，诊断医师应增加相应的冰冻切片质量评估流程，帮助冰冻切片不断提高制片质量。有些切片虽可满足常规的良恶性诊断，但其质量难以保障精细化程度更高的早期肺腺癌术中冰冻诊断，所以对于制片质量不佳的切片应要求重新制片，绝不可勉强诊断。

2.2 如何减少诊断不足

按照WHO的诊断标准，浸润范围5 mm是界定肿瘤是否超出微浸润性腺癌诊断的关键，因此在此之前，应保证在镜下能对浸润范围进行精确测量。虽然WHO推荐了可以用显微镜低倍镜视野作为测量标准，但实际每台显微镜的视野均有差异，应熟悉自己日常使用显微镜的视野大小，并在工作中做出相应调整。显微镜视野具体计算公式如下: 视野直径(mm)=目镜视场数÷物镜倍数(图1I)。

对于客观因素如组织病变不典型性是无法避免的，所以如何提前对这些不典型形态进行充分熟悉和理解成了解决这些问题的关键，有条件的单位可派诊断医师到肺部术中冰冻量较大的单位进行短期培训和进修，或参加一些相关主题的继续教育学习班。若无上述条件可借助文献中一些典型图片或者本院的典型石蜡切片与冰冻切片进行对照阅片帮助冰冻诊断的学习理解。当不典型病变特征是由于组织挤压造成时，可参考文献中提及的“术中冰冻肺组织膨胀法”，以2∶3比例稀释OCT包埋剂，由针筒于胸膜处注入肺组织，直到肺组织完全膨胀充盈再行取材[12]。需要说明的是，因冰冻中时间有限，且组织挤压并非冰冻中诊断升级的主要因素，故该法并未在本科常规开展，在此仅供有条件开展的单位做参考用。

对于主观因素，考虑到肺部亚专科病理医师术中冰冻及术后诊断一致率高于综合病理医师，同时有研究证明参与系统高效的阅片训练有助于提高早期肺腺癌诊断的一致率[13]，所以可通过增加院内阅片训练制度和院际阅片交流，增强诊断标准的一致性。

2.3 冰冻标本取样不足

对于取材不足: 为防止因取材质量不足造成的术后诊断升级，对于有条件的病例，应参考患者术前CT，了解患者肺内病变个数、位置及病变特点(病变大小、GGO深浅、是否混合性GGO)，既保证取材定位准确性，又帮助了解病变整体性质。当肿块直径≤1.5 cm时，应取肿瘤最大径切面完整切面;肿块>1.5 cm时，肿瘤应于最大径切面取材，取材组织大小应不小于1.5 cm，同时标本需包含肿瘤由内而外至肿瘤与正常肺组织交界处的各层级标本。当结节直径>1 cm时，冰冻切片诊断原位或微浸润性腺癌应谨慎对待，必要时(如病变浸润程度与影像学、大体所见不符或浸润灶位于切片边缘，周围无贴壁型腺癌围绕，在切片范围以外可能存在浸润范围的延续)应增加取材数量，避免因抽样误差造成的术后诊断升级。

对于取材层数不足: 在保证石蜡标本充足的前提下，当冰冻切片内病变浸润程度与影像学、大体所见不符时，可适当增加冰冻切片的层数和深度。

3 术中冰冻术后升级发生后的补救和应对

因冰冻切片的不足客观存在，对于术中冰冻术后升级的情况只能做到尽量避免，而无法完全消除。面对术后升级的病例时，应仔细寻找石蜡切片中是否存在亚肺叶切除复发的高危因素。根据现有的研究，亚叶切复发高危因素包括: (1) 亚叶切范围(段切、楔切)；(2) 显微镜下切缘受累情况；(3) 胸膜侵犯情况；(4) 脉管受累情况；(5) 肿瘤中含有>5%微乳头成分；(6) 肿瘤沿气腔内播散(spread through air spaces, STAS)[14-16]。根据本团队及其他一些相关研究的结果来看，大部分冰冻诊断不足病例即便在术后诊断升级、仍为分化较好的贴壁型为主腺癌，经过随访截止目前无复发转移和死亡事件发生，故不推荐升级后立即进行二次手术扩大切除[7,17]。但若升级后出现包含有亚叶切复发的高危因素，则应与临床医师及患者及时沟通，讨论是否有必要另行手术扩大切除。

4 总 结

通过对于冰冻诊断术后意外升级原因、减少意外升级方法，以及术后意外升级后对策的总结和归纳，将本团队早期腺癌术中冰冻诊断流程优化如下: (1) 有条件的情况下查看患者CT影像熟悉病变所在位置及影像学特点；(2) 结节最大切面取材，1.5 cm以下病变全取切面，1.5 cm以上取材覆盖由内而外各层结构；(3) 技术员标准化制片流程，每个病例切两个层面，保证冰冻切片质量；(4) 阅片医师评估切片质量，达标后方可进行诊断；(5) 熟悉自己的显微镜，以显微镜视野作为标尺精准测量浸润范围；(6) 提前熟悉了解常见不典型形态，在冰冻中作出合理评估；(7) >1 cm病例诊断原位腺癌、微浸润性腺癌谨慎小心，必要时增加取材块数;(8) 术后升级，仔细查看是否具有影响亚叶切预后高危因素后及时与临床进行沟通，见图3。希望通过上述流程优化，可以帮助广大病理科医师，尤其是肺部术中冰冻开展较少的基层单位快速领会和掌握一些技巧和要领，提高术中与术后诊断的一致性，尽量减少术后升级的可能。

图3 早期肺腺癌术中冰冻诊断流程图Fig.3 Flowchart of frozen section diagnosis for early lung adenocarcinoma