刘维辉 何清柳 穆 鑫 陈国锋 陈俊毅 李毅宁

（福建医科大学附属第二医院，福建 泉州 362000）

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，约95%为尿路上皮癌，手术治疗后易复发和进展[1-2]。程序性死亡受体1（Programmed cell death 1，PD-1）/程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PDL1）免疫检查点抑制剂仅对部分PD-L1 阳性表达的晚期膀胱尿路上皮癌患者有效。最新研究显示对于一些PD-L1 抗体治疗效果不佳的肿瘤，通过抑制肿瘤细胞外泌体PD-L1 的分泌并同时进行PDL1 抗体治疗，能够实现良好的抗肿瘤免疫疗效[3]。共刺激分子B7-H4 是PD-L1（又名B7-H1）同家族成员，通过抑制T 细胞功能参与肿瘤免疫过程，前期研究结果显示两者与膀胱尿路上皮癌发生发展和复发密切相关[4]。为进一步探究PD-L1 和B7-H4与膀胱癌恶性生物学行为的关系，本研究提取并鉴定两种膀胱癌细胞来源的外泌体，并检测外泌体携带PD-L1（exosomal PD-L1，exo-PD-L1）和B7-H4（exosomal B7-H4，exo-B7-H4）的表达，为后续研究exo-PD-L1 和exo-B7-H4 对膀胱癌复发和进展的作用机制作准备。

1 资料与方法

1.1 细胞的培养及PD-L1 和B7-H4 蛋白的检测：用10%胎牛血清的RPMI1640 细胞培养基培养细胞，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养及传代。细胞免疫组化染色检测目标蛋白的表达：细胞爬片贴壁成功后，4%多聚甲醛固定，0.5%TxitonX-100处理，山羊血清封闭，再分别加入B4-H4 和PD-L1单克隆抗体（1：200 稀释），分别加入酶标二抗PBS冲洗后加DAB 混合液，苏木素淡染30 秒，酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜观察。

1.2 超速离心法提取膀胱癌BIU-87 和T24 细胞和膀胱正常上皮SV-HUC-1 细胞上清外泌体：收集细胞培养48h 后上清。上清液800×g，4℃离心10min。将上清液移至新的离心管中，2000×g，4℃再次离心10min，以去除较大的囊泡。取上清液至新的离心管，超速转子，4℃，10，0000×g 离心1.5h。去除上清，用1mL 预冷PBS 重悬，超速转子，再次4℃，10，0000×g 离心17min。去除上清后50μl 的PBS 重悬，每个样品至少吹吸200 次。提取后的外泌体立即检测或者冻存-80℃保存。

1.3 透射电子显微镜（Transmission?electron microscope，TEM）观察膀胱癌细胞外泌体：将通过超速离心分离得到的外泌体取出5μL，重悬于30μL 的PBS 中。吸取样品10μL 滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。醋酸双氧铀（磷钨酸）10μL 滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。常温干燥数分钟。80kv 进行电镜检测成像。获得透射电镜（FEI Tecnai Spirit TEM T12）成像结果。

1.4 BCA 法测定膀胱癌细胞外泌体蛋白浓度：稀释BSA 标准品，配置BCA 工作液然后进行定量检测。

1.5 WB 检测外泌体标志蛋白及PD-L1、B7-H4 的表达：根据待检测样品蛋白大小配制浓度为12 %的SDS PAGE 电泳胶。将蛋白样品用移液器加入到电泳胶上的孔内。盖上槽盖，打开电源，跑胶。取出电泳胶，裁剪出相应大小的PVDF 膜。按照海绵-滤纸-电泳胶-膜-滤纸-海绵的顺序制作转膜“三明治”。300mA 转膜。取出PVDF 膜，一抗封闭（anti-TSG101 1：1000；anti-PD-L1 1：500；anti-B7-H4 1：500；anti-CD9 1：1000；anti-CD63 1：1000）。加二抗室温孵育1 h 左右。PVDF 膜上加ECL A/B 液混合液。将膜放在成像仪（GE LAS4000mini）中曝光，保存图片。

1.6 RT-PCR 检测SV-HUC-1 细胞中PD-L1 和B7-H4 的mRNA 的表达，WB 检测SV-HUC-1 细胞外泌体PD-L1 和B7-H4 蛋白表达：①选择生长良好的SV-HUC-1 细胞，按Trizol 法提取细胞总RNA，RT-PCR 试剂盒进行逆转录反应。根据人PD-L1 序列设计引物，正义序列5′-ACGCATTTACTGTCACGGTTCC-3′，反义序列3′-GACTTCGGCCTTGGGGTAGC-5′。根据人B7-H4 序列设计引物，正义序列5′TTAGGCTTGGTCCATGAGTTCA-3′，反义序列3′-TCTGTGAGTTGCACGTTTTTCAG-5′。以人β-actin 作内参。反应条件：50℃2min，95℃10min，然后95℃15 s，60℃1 min，共40 个循环。②WB 操作步骤参照1.1.5。

2 结果

2.1 PD-L1 和B7-H4 在膀胱癌BIU-87 和T24 细胞中的表达：膀胱癌BIU-87 和T24 细胞均有PDL1 和B7-H4 蛋白的表达，主要为胞浆表达，呈棕褐色，详见图1。膀胱正常上皮SV-HUC-1 细胞上无表达。

图1 膀胱癌细胞PD-L1 和B7-H4 蛋白的表达

2.2 膀胱癌细胞上清外泌体蛋白检测结果：BIU-87 和T24 细胞上清外泌体蛋白测出的OD560 值分别为0.34 和0.42，带入公式得出提取出的外泌体总蛋白浓度分别为1.88 μg/μL 和1.84 μg/μL，总体积都为90μL（外泌体重悬体积取45μL+裂解液体积45μL，约90μL），得出提取的蛋白总质量分别为169 μg 和166 μg，详见图2。

图2 BCA 法标准曲线

2.3 膀胱癌细胞外泌体形态及大小：TEM 观察下见BIU-87 和T24 细胞外泌体直径为30~150nm 的膜性囊泡，呈典型的“杯盘”形态，详见图3。

图3 电镜下膀胱癌细胞外泌体形态及大小

2.4 膀胱癌BIU-87 和T24 细胞外泌体标志蛋白及PD-L1、B7-H4 的表达鉴定：WB 检测到BIU-87和T24 细胞上清外泌体的标志蛋白CD63 和CD9。同时，PD-L1 和B7-H4 均表达在exo-BIU-87 和exo-T24 中，详见图4。

图4 BIU-87 和T24 细胞上清外泌体标志蛋白和PD-L1、B7-H4 的表达

2.5 exosome 与SV-HUC-1 细胞共培养后PD-L1和B7-H4 蛋白的表达：膀胱癌细胞外泌体与SVHUC-1 细胞共培养48h 后，RT-PCR 检测SVHUC-1 细胞无PD-L1 和B7-H4 的mRNA 表达，WB 检测PD-L1 和B7-H4 蛋白表达阳性，详见图5。

图5 exosome 与SV-HUC-1 细胞共培养后PD-L1 和B7-H4 蛋白的表达

3 讨论

外泌体是由细胞内多囊泡体（Multivesicularbody，MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。直径为30～150nm，可由多种不同类型细胞分泌，多种体液及培养的肿瘤细胞上清液中亦检测到衍生的外泌体存在，其携带并转运蛋白质、脂类、DNA、miRNA 和非编码RNA 等多种信号分子，广泛参与细胞间通讯、血管生成、肿瘤免疫和机体代谢改变等生物学过程[5]，被认为是细胞间信号传递的第三种途径[6]。

膀胱癌患者血液、尿液及肿瘤细胞上清液的外泌体中已检测出包括蛋白质、miRNA 和长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在内的多种遗传信息存在差异性表达。外泌体中的内皮细胞糖蛋白能促进膀胱癌细胞迁移和内皮细胞的血管生成。多种膀胱癌衍生外泌体的miRNA 具有膀胱癌诊断标志物的潜力[7]。膀胱尿路上皮癌相关的lncRNA可促进膀胱癌细胞迁移和侵袭[8-9]。目前膀胱癌细胞来源的exo-PD-L1 和exo-B7-H4 的表达及对膀胱癌恶性生物学行为的作用研究鲜有报道。

PD-L1 和B7-H4 均是T 细胞活性抑制剂，是一类调节免疫应答的B7 家族共刺激分子，肿瘤细胞可以通过两者介导的逃逸机制来逃避免疫监视和杀伤，已有报道PD-L1 和B7-H4 在膀胱癌、子宫内膜癌和肾细胞癌组织中存在共表达，参与了肿瘤的恶性生物学行为。PD-L1/PD-1 免疫检查点抑制剂在膀胱尿路上皮癌、肾癌和肺癌等恶性肿瘤中的疗效已得到确认，然而只有10%~30%的患者对PD-L1/PD-1 抗体治疗有显著疗效。最新研究发现，PD-L1 也存在于恶性肿瘤外泌体中，并且其水平与肿瘤进展密切相关。exo-PD-L1 能够促进PD-L1抗体治疗的耐受性，对于PD-L1 抗体治疗无效的前列腺恶性肿瘤，PD-L1 及其外泌体都促进癌细胞生长。在结直肠癌模型中，PD-L1 抗体与抑制exo-PD-L1 分泌可共同实现肿瘤抑制效果。通过抑制exo-PD-L1 分泌可增强T 细胞对乳腺癌细胞的杀伤，发挥强大的抗癌作用。转移性黑色素瘤患者外周循环中exo-PD-L1 不仅抑制CD8+T 细胞的功能促进肿瘤生长，且患者体内exo-PD-L1 水平与抗PD-1 治疗反应敏感性相关，能预测抗PD-1 治疗结果。因此，exo-PD-L1 被认为是一种新的免疫治疗靶点，可能解决目前PD-L1 抗体治疗存在的耐受性问题。

基于肿瘤exo-PD-L1 能影响PD-L1/PD-1 免疫检查点抑制剂临床治疗耐受性的最新研究结果，为进一步阐明PD-L1 和B7-H4 对膀胱尿路上皮癌复发和进展的作用机制，本研究培养膀胱癌BIU-87 和T24 细胞，细胞免疫组化染色确定PD-L1 和B7-H4 蛋白表达于两种膀胱癌细胞，多步骤超速离心法成功提取两种膀胱癌细胞上清液的外泌体，首先TEM 下观察外泌体的大小和形态，并通过检测外泌体标志蛋白CD63 和CD9 予以鉴定，最后证实两种膀胱癌细胞上清液外泌体均携带PD-L1 和B7-H4。将膀胱癌细胞外泌体与膀胱正常上皮SVHUC-1 细胞共培养后，发现膀胱肿瘤微环境中的外泌体能将PD-L1 和B7-H4 传递给正常膀胱上皮细胞，且这种传递不是通过mRNA 来呈现，而是直接以蛋白表达的形式，相一致，说明膀胱肿瘤微环境中外泌体直接在翻译层面传递PD-L1 和B7-H4。本研究结合前期研究结果显示不仅膀胱癌组织存在PD-L1 和B7-H4 异常表达，两者与膀胱癌复发进展密切相关；而且膀胱癌BIU-87 和T24 细胞亦表达PD-L1 和B7-H4，上清液中外泌体携带PD-L1 和B7-H4 蛋白，且后两者能通过外泌体在膀胱肿瘤微环境中传递。后续我们将建立动物模型来研究exo-PD-L1 和exo-B7-H4 与膀胱癌恶性生物学行为的关系以及对免疫检查点抑制剂耐受性的影响，为寻找新的膀胱癌免疫治疗靶点作准备。