松针挥发油对氯仿诱发小鼠心室颤动的影响

2020-09-24黄雪泉刘明春蒋能高

山东畜牧兽医 2020年9期

黄雪泉刘明春蒋能高

松针挥发油对氯仿诱发小鼠心室颤动的影响

黄雪泉刘明春蒋能高

（广西柳州畜牧兽医学校广西柳州 545003）

试验采用吸入氯仿复制小鼠心律失常的动物模型，观察灌胃给药松针挥发油对抗氯仿诱发小鼠心律失常的作用。结果发现，松针挥发油低剂量组(0.320ml/kg)对氯仿所致小鼠心室颤动与阴性对照组相比具有显著对抗作用(P<0.05)，中剂量组(1.010ml/kg)、高剂量组(3.194ml/kg)和美西律组(80mg/kg)对氯仿所致小鼠心室颤动与阴性对照组相比具有极显著对抗作用(P<0.01)。说明松针挥发油对氯仿诱发的心律失常具有对抗作用，具有与I类抗心律失常药的作用。

松针挥发油氯仿诱发小鼠心室颤动

松针(Pine needles)为松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物的针叶，全世界松有一百多种，在广西境内分布的主要为云南松和马尾松。其松香、松实、松针历代均入药用，而松针采集最为方便[1]，目前国内外对松针的研究和利用重点均放在了松针及提取物营养方面[2]；但对松针挥发油药理作用研究鲜少，本试验测定松针挥发油对昆明种小鼠氯仿诱发小鼠心律失常的影响，观察其微观药用效果，对其药理作用进行研究，旨在为研究开发松针挥发油产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 提取马尾松松针挥发油方法供试参照《中国药典》2000年版一部附录XD挥发油测定法(甲法)[3]，将1000g马尾松新鲜针叶全剪为3.5cm长的规格，置入6.5L的高压锅内，加清水2000ml，稍拌后加盖紧盖好；锅置1000W的电炉上，再用乳胶管连接高压锅的出气管口，乳胶管另一端连接测定器的分叉管口；将测定器套紧回流冷凝管，然后安装其余部件；整个装置装好后，检查确保牢稳、密闭；开电炉加热，待观察到有水蒸气进入乳胶管中时开冷凝水，进行蒸馏提取；提取过程中要求有一操作者坐在冷凝回收系统前，从测定器下端不断放走冷凝水(冷凝水收集于一烧杯内并将其盖好)，待有2cm左右高度的挥发油后放之入玻璃小瓶内、盖好；不断接收至出油量很少为止。对于盛放挥发油小瓶中可能混入的少量水，可用注射器小心将水抽出；将所得挥发油装棕色瓶密封后置-20℃冰箱内[4]。全部药液用高压灭器灭菌，1210C灭菌15~20min，取出后置于40C冰箱中保存备用。

1.1.2 药品及试剂松针挥发油药液配制：量取挥发油0.79、2.50、7.91ml，分别以1%吐温-80生理盐水配为120ml，即得松针挥发油的高、中、低给药浓度；配好的药液装瓶盖紧置4℃冰箱存放，每天灌胃前2h将药取出，使药液温度和室温平衡。聚山梨酯-80(吐温-80)，江苏省无锡市亚泰联合化工有限公司生产(批号201800401)；美西律片，上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂生产(批号180302)；氯仿，重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂生产(批号20180615)；生理盐水，山东辰欣药业股份有限公司(批号1808290723)。

1.1.3 仪器和器材 RM6240C型多道生理记录处理系统为广东省东莞市塘厦兴万电子厂生产，针型电极为江苏科伦医疗器械有限公司生产。

1.1.4 实试动物用4~5周龄昆明种小鼠150只，雌雄各半，体重25~30g，从广西医科大学实验动物中心购买(使用许可证：SYXK桂2014-0002)。动物在试验前适应性饲养一周，动物房温度20± 3℃、湿70%左右。标准全价颗粒饲料由该实验动物中心提供。试验期间动物自由饮水、摄食。

1.2 方法

1.2.1 小鼠预筛试验自整批小鼠中随机取30只，逐一将小鼠放入含有2ml氯仿的棉球(以后每换一只小鼠加入1ml氯仿)倒置的600ml烧杯内，使吸入氯仿直至呼吸停止。立即取出小鼠，仰位固定，标准肢II导联测心电图，通过心电图判断室颤发生率。心室颤动发生率在80%以上方能使用该批小鼠进行正式实验[5]。

1.2.2 分组给药及造模方法小鼠随机分为五组，每组3个重复，每个重复10只，灌胃给药；实验组分别给予松针挥发油高、中、低剂量，给药剂量如表1所示，给药容量均为0.2ml/10g体重；阳性对照组给予美西律80mg/kg[6]；阴性对照组给予等容量1%吐温-80生理盐水。每日9时灌胃，1次/d，连续给药6d。于末次给药1hr后，取1.5g脱脂棉，浸含氯仿2ml，放入倒置的600ml烧杯中；逐一将小鼠放入烧杯内，使吸入氯仿直至呼吸停止。立即取出小鼠，仰位固定，迅速以针型电极插入三肢皮下记录标准肢体II导联心电图(ECG)，通过心电图判断室颤发生率。比较试验组与对照组室颤发生率的差别。

1.2.3 测定小鼠心电图（1）用RM6240C型多道生理记录处理系统测定正常小鼠心电图，正常小鼠心电图无Q波，且S-T段短，心电测定参数为20ms/div，1ms，0.02s，100Hz，zoom(1/2)。（2）测定氯仿空白组诱发小鼠发生的室颤，心电测定参数为5ms/div，200μv，0.02s，30Hz，zoom(1)。（3）分别测定氯仿法松针挥发油低剂量组(0.320ml/kg)、中剂量组(1.010ml/kg)、高剂量组(3.194ml/kg)的小鼠心电图，均能抵抗小鼠室颤发生。心电测定参数分别为20ms/div，200μv，0.02s，30Hz，zoom(1)；10ms，400μv，0.2s，30Hz，zoom(1)；40ms，200μv，0.2s，30Hz zoom(1)。

1.3 统计方法

采用SPSS11.0统计软件的One-way ANOVA，检验各治疗组、阳性对照组与阴性对照组的各计量指标的差别，试验数据用平均数±标准误表示。

2 结果(见附表)

附表松针挥发油对小鼠室颤模型的保护作用(n=7-10)

组别剂量(ml/kg)室颤率阴性对照组-73.333±3.331 挥发油低0.32040.000±5.775※ 挥发油中1.01024.000±3.063※※ 挥发油高3.19416.270±2.913※※ 美西律组8023.333±8.820※※

注：与阴性对照组对比※P<0.05，※※P<0.01

从试验结果(表1)可知，发现松针挥发油低剂量组(0.320ml/kg)对氯仿所致小鼠心室颤动与阴性对照组相比具有显著对抗作用(P<0.05)，中剂量组(1.010ml/kg)、高剂量组(3.194ml/kg)和美西律组(80mg/kg)对氯仿所致小鼠心室颤动与阴性对照组相比具有极显著对抗作用(P<0.01)。

3 讨论

3.1 松针挥发油的提取和配制

挥发油是植物中一类具有芳香气味、在常温下能挥发的油状液体的总称。挥发油在植物界分布很广，特别是菊科、樟科和姜科等植物中[7]。本实验使用水蒸气蒸馏法自马尾松针叶中提取出总挥发油，其化学成分复杂。据文献记载主要含有萜烯为主的一系列不饱和碳氢化合物及其衍生物，如α-蒎烯、β-丁香烯等。高效毛细管气相色谱法测定松叶中α-蒎烯的含量说明：松针的干品和鲜品的α-蒎烯的含量差异显著[8]。故松针采回后应立即进行提取，以减少其挥发性成分耗散。挥发油提取后冷藏-20℃冰箱中以减少其挥发和保持其成分稳定。吐温-80是一种乳化剂也是挥发油的助溶剂。实验初时以1%的吐温-80生理盐水液溶解松针挥发油，发现静置片刻即分层，故改用5%的吐温-80生理盐水液，结果挥发油较易溶且不分层[9]。

3.2 心律失常动物模型构建

研究抗心律失常药，需要心律失常动物模型[9]。实验性心律失常方法较多，如药物诱导心律失常法、电刺激引起心律失常法、结扎冠状动脉引起心律失常法等。但目前尚无一个理想的心律失常动物模型，因此，常需要几种模型相互配合来分析抗心律失常药作用机理[10]。考虑本课题实验研究的目的和实验室现有条件等因素，本课题采用了氯仿致小鼠心室颤动作为初筛实验；通过肢体标准II导联记录心电图来观察心律失常发生、持续时间和心律失常类型等。试验采用预防给药法。

3.3 松针挥发油对小鼠室颤的影响

挥发油低(0.320ml/kg)、中(1.010ml/kg)、高(3.194ml/kg)剂量小鼠灌胃6d，对氯仿致小鼠室颤具显著对抗作用(与阴性对照组比P<0.05)，说明其可能可以阻止氯仿致的Adr-R依赖性Ca2+内流作用[11]。本试验中高剂量组的小鼠死亡较多(死亡3只)，怀疑该剂量对小鼠来说还是过高。因为当初给药剂量的确定是根据林健等文献记载的松针挥发性成分小鼠Po的LD50>18g/kg来折算的，折算结果可能与实际药物作用有一定的差距，但此实验为下一步实验的用药剂量提供了参考数据。

3.4 氯仿、美西律的作用机理

3.4.1 氯仿的作用机理氯仿诱发心律失常，可能与促使Adr-R依赖性Ca2+内流有关；与自主神经及其递质的释放、肾上腺髓质分泌以及对心脏的直接作用有关。肾上腺素激活心肌细胞膜的β受体，使心肌细胞内Ca2+过量而诱发心律失常[11]。本实验采用以上实验方法，可以考察松针挥发油对Ca2+、Na+离子分布及其通道的影响；还考察了挥发油对多因素如自由基损伤及钙反常现象的影响；本试验法是较成熟的，因此能较好的达到试验目的。

3.4.2 美西律的作用机理美西律主要作用于希—浦系统，可缩短浦肯野纤维的动作电位时程和有效不应期且缩短动作电位时程更为明显，故相对延长有效不应期；大剂量还可减慢传导。美西律可口服应用，且吸收迅速而完全，生物利用度高。用于治疗各种快速性心律失常，如早搏、心动过速等[12]。本试验发现其对氯仿所致小鼠的室颤具有显著对抗作用。

3.5 挥发油灌胃剂量的摸索

松针挥发油的灌胃剂量，预实验时以文献记载[13]的其挥发性成分小鼠Po的LD50>18g/kg来折算小鼠灌胃给药剂量:即高剂量为6.39ml/kg小鼠；中剂量为2.02ml/kg小鼠；低剂量为0.64ml/kg小鼠。但以此剂量灌胃几天后发现小鼠摄食减少，毛色差，体重下降且高剂量组的小鼠死亡较多。故认为此剂量偏高了，是造成本实验中高剂量组的小鼠在实验过程中死亡较多的原因。于是调整正式实验的灌胃剂量且以小鼠的中剂量的1/2折算为灌胃的高剂量即1.01ml/kg，调整灌胃剂量后，在另一个实验中发现此剂量对小鼠是合适的，小鼠在实验过程中死亡减少。将来可以松针挥发油的准确灌胃剂量进行进一步研究。