史丽芳，余东林，刘雪会，吕 湘

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

β-地中海贫血(β-thalassemia)是全球最常见的单基因遗传病，通常由β-珠蛋白基因点突变或缺失导致β-珠蛋白链的产生减少或完全缺乏，引起两类珠蛋白合成失衡所致[1-2]。人β-珠蛋白基因第2个内含子中第654位核苷酸剪接缺陷型突变(β-654)是中国汉族人中最常见的β-地中海贫血(简称“β-地贫”)突变类型[3]。患者由于C→T突变导致β-珠蛋白基因的异常剪接，仅有约15%的正常β-珠蛋白基因表达[4]。游离的α-珠蛋白链启动氧化损伤级联反应并形成不溶性沉淀，损伤红细胞，导致溶血性贫血和骨髓无效造血。除增加类β-珠蛋白表达之外，消除过剩的α-珠蛋白链或减少其错误折叠所形成的包涵体也是β-地贫实验性治疗的重要策略之一。

细胞通过蛋白质量控制(protein quality control,PQC)机制选择性地识别错误折叠的蛋白，防止其形成沉淀，降低其细胞毒性[5-9]。PQC机制包括分子伴侣、泛素介导的蛋白水解和自噬。基于小鼠胎肝红系前体细胞的转录组研究发现，β-地贫红系前体细胞高表达多种蛋白酶体亚基[10]，通过增强的蛋白酶体活性降解过量α-珠蛋白链，但对于地贫红系终末分化各时期PQC调控的动态变化尚不清楚。因此，本研究旨在通过红系终末分化阶段特异性的转录组分析，绘制β-地贫红系前体细胞的转录时序调控图谱，探寻新的潜在地贫治疗靶标。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 地中海贫血小鼠模型:βIVS-2-654地贫小鼠模型购自Jackson实验室(http://jaxmice.jax.org/)。βIVS-2-654地贫小鼠模型是将小鼠基因组中包含β-major和β-minor珠蛋白基因的21 kb DNA片段，置换为包含人IVS-2-654基因的5.7 kb DNA片段，所产生的突变称为Hbbth4，嵌合体小鼠与C57BL/6J杂交产生F1代。纯合子小鼠由于贫血严重导致胚胎致死，杂合子小鼠(Hbbth4/Hbb+)带有一个野生型β-珠蛋白等位基因及1个人βIVS-2-654突变等位基因，属于中间型地贫[11]。

实验所用地贫杂合子小鼠为β-654小鼠与C57BL/6J回交至少5代以上所得。选取上述8～10周龄的雄性β-654小鼠3只作为实验组，对照组为与3只地贫小鼠同窝的野生型(WT)小鼠。

1.1.2 主要试剂:鼠尾裂解液(0.1 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.5 mol/L KCl，0.1 mg/mL 明胶，0.45% NP40，Sigma-Adrich公司)；蛋白酶K(Promega公司)；基因型鉴定PCR试剂2XRapid TaqMaster Mix (Vazyme公司)；基因型鉴定引物(生工生物公司合成)序列如下：β-654_WT-上游引物：5′-GATCCTATTGCCATGCCCTA-3′，β-654_WT-下游引物：5′-CTGTGCAGGCATGGTATGAC-3′，β-654_Mu-上游引物：5′-ACTCCTAAGCCAGTGCCAGA-3′，β-654_Mu-下游引物：5′-TGGTGTCTGTTTGAGGTT GC-3′；CD45磁珠(MILtenyi公司)；抗体CD16/CD32(mouse BD Fc Block)、FITC Rat Anti-mouse TER119、PE Rat Anti-mouse CD44、APC-Cy7 Rat Anti-mouse GR1、APC-Cy7 Rat Anti-mouse CD45、APC-Cy7 Rat Anti-mouse CD11b、细胞核染料7AAD(BD Bioscience公司)；细胞裂解液A&B(极客基因公司)；全转录组建库试剂盒Hyper Prep Kits (KK8504，KAPA公司)；瑞氏吉姆萨染液(BA-4034，贝索生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 β-654小鼠的基因型鉴定:待鉴定小鼠长至2周时剪下鼠尾末稍，加入含蛋白酶K的鼠尾裂解液，55 ℃金属浴过夜，加100 μL ddH2O后100 ℃煮沸10 min，取上清进行PCR鉴定。引物见1.1.2，退火温度为65 ℃，循环数为35。β-654杂合子小鼠(Hbbth4/Hbb+)带有1个野生型β-珠蛋白等位基因及1个人βIVS-2-654突变等位基因，小鼠鉴定引物分别设在人βIVS-2-654等位基因及小鼠β-major基因上，因此电泳结果仅1条带(340 bp)的为野生型小鼠，2条带(340和214 bp)的为地贫小鼠。

1.2.2 小鼠外周血瑞氏吉姆萨染色:取10 μL小鼠外周血液滴在载玻片上，用盖玻片轻轻推平。滴加染色试剂A液2～3滴，使其覆盖血膜，染色1 min左右；滴加B液4～6滴(用量为A液2倍)，轻摇玻片使染色液充分混匀，染色6～8 min；水洗，吹干后镜检。

1.2.4 红系前体细胞的流式分选：首先根据7AAD强度去除染色阳性的死细胞，得到活的单细胞群P1，进一步根据CD45-/GR1-/CD11b-APC-Cy7剔除残留的白细胞，选出CD45-GR1-CD11b-细胞群P2。根据TER119强度从中选出TER119+红细胞P3，原始红细胞(ProE)为CD44hiTER119low群体P4，再根据CD44荧光强度和FSC大小进行画门，按照CD44表达的强弱，从上到下分别画出早幼红细胞(BasoE) P5、中幼红细胞(PolyE) P6、晚幼红细胞(OrthoE) P7、网织红细胞(Ret) P8和成熟红细胞(RBC) P9(图1)。分选模式设置为“纯度”，流速设置为10，同时收集原红至晚幼红4种分化阶段的细胞[12]。

1.2.5 RNA表达文库构建及测序：分选获取的细胞105～106个，于4 ℃ 2 000×g离心10 min，弃上清，用细胞裂解液A&B 裂解细胞。基于Illumina平台用KAPA Hyper Prep Kits (KK8504)试剂盒进行文库构建；上机测序：基于Illumina Novaseq技术测序平台，利用双末端(Paired-End,PE)测序PE150的方法进行上机测序。

图1 小鼠骨髓不同成熟阶段红系前体细胞流式分选图Fig 1 Flow cytometry gating and isolation of mouse bone marrow erythroblasts of different maturation stage

1.2.6 RNA-seq生物信息分析：使用FastQC对数据进行质控，Cutadapt去除接头序列和Trimmomatic[13]去除低质量的序列，Hisat2[14]比对到小鼠mm10基因组，Samtools[15]统计汇总比对结果，FeatureCounts[16]计数，构建基因表达矩阵。

对24个样本(β-654地贫及对照小鼠骨髓红系细胞，各4个不同成熟阶段，3个重复)做主成分分析，除了β-654 地贫的晚幼红细胞有一个样本离群外，每种细胞的3个重复聚类良好。去除离群样本后，用DESeq2[17]分别对4个时期数据做差异表达分析，筛选标准为Padj<0.05且|log2FoldChange|>1。然后通过BioMart对差异表达基因进行基因ID转换和注释。用ClusterProfiler[18]对各个阶段的差异基因进行GO富集分析。将这些差异表达基因上传到STRING数据库(https://string-db.org/)构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，导出tsv文件，利用Cytoscape软件(https://cytoscape.org/)的cytohubba插件寻找关键基因。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 β-654地贫小鼠表型及骨髓红系细胞流式分选

首先鉴定了地贫小鼠和野生型小鼠的基因型(图2A)；尾静脉取血进行血涂片，可见野生型小鼠外周血红细胞呈双凹圆盘状(图2B)；而β-654地贫小鼠的红细胞大小不一，形状不规则，出现球形或口红形红细胞，并可见细胞碎片(图2C)。骨髓细胞流式分析结果(表1)显示，地贫小鼠的红系前体细胞数量明显增多，而网织红和成熟红细胞显著减少，骨髓呈无效造血状态。

A.electrophoretic map for genotype identification of β-654 thalassemia and control mice;B,C.representative blood smear Wright-Giemsa staining of WT (B) and β-654 thalassemia (C) mice;scale bar=50 μm图2 β-654地贫及对照小鼠基因型鉴定与血涂片瑞氏吉姆萨染色Fig 2 Genotyping and blood smear Wright-Giemsa staining of β-654 thalassemia and control mice

表1 β-654地贫及对照小鼠骨髓红系分化各时期细胞比例分析Table 1 Proportion of erythroblasts at distinct maturation stages in bone marrow of β-654 thalassemia

2.2 β-654地贫小鼠骨髓红系终末分化阶段特异性差异表达基因分析

分别收取β-654地贫和对照小鼠骨髓红系终末分化4个时期的前体细胞进行转录组建库和测序(测序深度：6G)，过滤接头序列和低质量序列后比对到小鼠mm10基因组，获得地贫与对照小鼠骨髓红系终末分化各阶段前体细胞的RNA表达谱。根据差异基因判断标准Padj<0.05且|log2FoldChange|>1，获得差异表达基因。从原始红、早幼红、中幼红到晚幼红细胞的4个分化时期，地贫与对照红系细胞差异基因的个数分别为856、886、1 171、1 715个，其中上调基因分别为27、102、48、261个，下调基因分别为829、784、1 023、1 454个(图3)。各时期特异的差异基因个数分别为10、30、59、182(上调)及290、123、144、528个(下调)。地贫红系前体细胞四个时期的差异表达基因以下调为主，且随着分化的进行，差异表达基因数目逐渐增多。地贫原始红细胞和早幼红细胞中显著上调的基因有Podxl，而中幼到晚幼时期Hspa1a、Hspa1b、Hsph1等基因显著上调，其中Podxl在造血分化中发挥重要的作用，而Hsp是热休克蛋白家族成员，在介导变性蛋白质重折叠过程中发挥重要的作用。

2.3 β-654地贫小鼠骨髓红系终末分化差异表达基因的GO分析

进一步对鉴定的地贫小鼠红系前体细胞与同期正常对照细胞差异表达基因进行GO富集分析，其中下调基因主要富集在正向调控细胞间黏附(positive regulation of cell adhesion)、正向调节细胞因子生成(positive regulation of cytokine production)、负向调控免疫系统(negative regulation of immune system process)、与肌动蛋白、糖、磷脂的结合(actin binding，carbohydrate binding，phospholipid binding)等生物学过程和分子功能(图4A)，在各分化时期无明显区别。在正向调控细胞间黏附条目中包含黏附分子Vcam1，它可以介导中心巨噬细胞与红细胞相互作用以促进红系分化。

地贫状态下表达上调的基因在原始红细胞时期较少，GO富集没有结果，早幼红至晚幼红时期上调基因均富集在蛋白折叠、结合(protein folding、unfolded protein binding)、热休克蛋白结合(heat shock protein binding)、ATP酶调节因子活性(ATPase regulator activity)等生物学过程和分子功能(图4B)，且总体上富集程度随分化进程越来越显著。值得注意的是，氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)分子功能特异在早中幼地贫红细胞中富集，而泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)分子功能特异在中晚幼地贫红细胞富集，此外，晚幼地贫红细胞还富集端粒维持(telomere maintenance)生物过程。

2.4 β-654地贫小鼠骨髓红系差异表达基因的蛋白质相互作用网络分析

通过STRING数据库和Cytoscape对地贫小鼠各时期红系细胞中上调基因进行蛋白质间相互作用分析并展示，预测关键调控基因。预测结果提示，早幼红至晚幼红细胞蛋白质相互作用的网络核心包括Hsp90(Hsp90aa1/Hsp90ab1)、Hsp110 (Hsph1)和Hsp40(Dnaja1/Dnajb1/Dnaja4)复合物，中幼红及晚幼红细胞的网络核心加入了Hsp70(Hspa8/Hspa1b/Hspa1a)，晚幼红细胞的网络核心还加入了Hsp60(Hspd1)、Hsp10(Hspe1)(图5)。

A.venn diagram of up-regulated genes；B.venn diagram of down-regulated genes图3 β-654地贫与对照小鼠骨髓红系终末分化各时期差异表达基因图谱Fig 3 Venn diagram of differentially expressed genes in stage-matched bone marrow erythroblasts of β-654 thalassemia and control mice

图4 β-654地贫小鼠骨髓红系终末分化各时期相比同期对照细胞下调(A)和上调(B)基因的GO富集分析Fig 4 Gene ontology analysis of the stage-specifically down-regulated(A) and up-regulated(B) genes in bone marrow erythroblasts of β-654 thalassemia mice

3 讨论

本研究通过流式分选和RNA-seq数据分析探究了β-654地贫小鼠骨髓红系终末分化的阶段特异性转录组特征。通过对原始红细胞至晚幼红细胞4个时期的转录组学数据分析，发现地贫红系细胞相比正常对照的差异基因数目随红系终末分化进程逐渐增多。GO分析显示β-654地贫红系分化过程中分子伴侣介导的蛋白质折叠等生物过程被激活且随分化逐渐强化。蛋白质相互作用网络分析揭示了Hsp家族成员构成β-654地贫红系细胞表达上调基因的网络核心，且核心中的Hsp家族成员数目随红系终末分化进程逐步增多。

分子伴侣Hsp通过结合错误折叠的蛋白质来稳定并重塑其结构，抑制蛋白形成沉淀。本研究发现在β-654中间型地贫小鼠骨髓红系分化中Hsp发挥重要作用。Hsp70 mRNA水平从地贫中幼红时期开始上调，而Hsp90、Hsp110和Hsp40则先于Hsp70在早幼红时期就表达升高。Hsp90参与血红蛋白的成熟，其与无血红素的γ-珠蛋白和β-珠蛋白结合，辅助血红素的插入[19]。Hsp110是Hsp70的核苷酸交换因子，此外，该蛋白作为一种抑制错误折叠蛋白聚集的保持酶(holdase)发挥着独特的作用[20]。Hsp40可刺激Hsp70的ATPase活性，从而促进蛋白折叠并防止蛋白折叠错误[21]。Hsp70在红细胞成熟后期移位到细胞核中，保护GATA-1不受caspase-3的切割，使红系前体细胞免于凋亡。而在β-地贫红细胞成熟过程中Hsp70直接与游离的α-珠蛋白链相互作用，使Hsp70被隔离在细胞质中失去对GATA-1的保护作用，导致终末成熟停滞和凋亡[22]。另外，地贫晚幼红细胞中进一步发现Hsp60与Hsp10表达升高，与Hsp70主要识别延展肽链上的疏水区不同的是，Hsp60与Hsp10主要识别球形构象的疏水表面，促进错误折叠蛋白恢复天然构象[23]。

此外，本研究还发现地贫鼠骨髓红系终末分化具有阶段特异性的生物学过程。如氧化还原酶活性在早幼至中幼地贫红细胞中上调，到晚幼红时期则与正常对照间不再有显著差异；而从中幼红到晚幼红细胞阶段地贫红细胞中出现泛素蛋白连接酶结合过程增强。推测地贫红系终末分化早期由于游离α-珠蛋白链及其降解产物产生氧自由基相对较少，加强氧化还原酶活性可以减少细胞氧化损伤[24]，到分化中期以后珠蛋白表达水平显著升高，则以泛素-蛋白酶体降解游离α-珠蛋白为主。

A.protein-protein interaction network of BasoE stage thalassemic up-regulated genes;B.protein-protein interaction network of PolyE stage thalassemic up-regulated genes;C.protein-protein interaction network of OrthoE stage thalassemic up-regulated genes;the top 10 hub genes were highlighted图5 β-654地贫小鼠骨髓红系终末分化各时期上调差异基因的蛋白质间相互作用网络图Fig 5 Protein-protein interaction network of thalassemic over-expressed genes at distinct erythroid maturation stages in bone marrow of β-654 thalassemia mice

在Hbbth3地贫小鼠胎肝红系前体细胞的转录组研究中，发现蛋白酶体多个亚基表达上调[25]，而抑制蛋白酶体活性后可代偿性激活Hsp及自噬以缓解游离α-珠蛋白的细胞毒性。在本研究中，主要是Hsp家族表达显著上调，地贫晚幼红细胞中才出现泛素-蛋白酶体系统的激活。推测与前人研究结果有所不同的原因有二：一是胎肝和骨髓两种组织来源不同；二是两种地贫小鼠贫血严重程度不同，Hbbth3属于β0重型地贫，而β-654属于中间型地贫。另外，有报道在地贫患者外周血转录组分析发现红细胞凋亡严重[26]，而在本研究中没有明显的细胞凋亡通路富集，可能与细胞来源的差别有关，前人的研究样本是外周血细胞，本研究样本是红系前体细胞。与此一致的是，本研究也在流式分选中观察到β-654小鼠骨髓红系细胞的大量减少主要发生在网织红和成熟红细胞阶段。

综上所述，本研究揭示了β-654地贫小鼠骨髓红系终末分化各时期的转录组特征，为β-地贫红细胞中过剩α-珠蛋白链包涵体的消除提供了新的线索。