李玖玲，张子归，郭 莉*

(华中科技大学 同济医学院附属武汉市中心医院 1.肾内风湿免疫科；2.分子诊断湖北省重点实验室，湖北 武汉 430014)

全球癌统计数据表明，2018年全世界肾癌(renal carcinoma)的新增40.3262万例、病死17.5098万例，分别占全球癌发病率的2.2%和病死率的1.8%[1]。由于肾癌对化疗和放疗有很强的抵抗力，治疗后的长期预后仍不理想。因此，了解肾癌发生和发展的分子机制对于寻找新的肾癌预后、治疗和诊断生物标志物具有重要意义。

MicroRNA(微小RNA，miRNA)是由18-25个核苷酸组成的内源性小分子非编码RNA，研究表明在肾癌中也证实了miRNA的异常表达水平影响肾癌的发生和发展[1]。当前研究发现miR-299-3p具有参与调控结肠癌、甲状腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌等多种恶性肿瘤细胞增殖、迁移和药物敏感性等功能[5-8]，然而miR-299-3p在肾癌中对肿瘤增殖和迁移的分子机制还未有报道，因此选择miR-299-3p作为研究的标靶。并探讨了miR-299-3p在肾癌细胞中的作用和分子机制，以期为寻找新的肾癌预后评估、临床治疗和诊断的生物标志物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人肾癌细胞系(786-O、769-P、ACHN和A498)和人正常肾小管上皮细胞系(HK-2)(中国科学院上海细胞库)。

1.1.2 主要试剂：miR-299-3p mimic，NC-mimic(广州锐博生物科技有限公司)；鼠抗人MAP3K12、E-cadherin、vimentin、N-cadherin、GAPDH抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；DMEM培养基和胎牛血清(Gibco公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；Fast-Start Universal SYBR Green Master (Rox)试剂(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的处理及分组：调整肾癌786-O细胞密度为 1×105个/mL。然后将细胞接种到6孔板，培养24 h后进行转染，分别设置miR-299-3p mimic组、NC-mimic组和空白对照组，其转染方式参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行。

1.2.2 RNA提取、q-PCR检测miR-299-3p和MAP3K12的表达量：收集转染48 h后的786-O细胞，并采用Trizol试剂分别提取各组细胞中的总RNA。Fast-Start Universal SYBR Green Master (Rox)试剂对miR-299-3p和MAP3K12的相对表达进行检测，分别以U6和GAPDH作为miRNA和mRNA的内参。引物序列：GAPDH上游引物:5′-ATGTTCGT CATGGGTGTGAA-3′，下游引物:5′-CAGTGATGGC ATGGACTGT-3′；U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCA GCACA-3′，下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTG CGT-3′；miR-299-3p上游引物:5′-TTCAGTGTAAAC ATCCTCGACTG-3′,下游引物:5′-TGGCAATGTCGTG GAGTCG-3′；MAP3K12上游引物:5′-GTGTGGG AAGCAACAGTCTC3′,下游引物:5′-TACTTCTTCC CGCCACTCTG-3′。PCR扩增条件:95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

1.2.3 荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性：培养786-O细胞至50% ～ 70%汇合时，按照转染试剂说明书将质粒载体共转染转入细胞，实验分为4组，每组设3个复孔:1)NC-mimic+MAP3K12 WT；2)miR-299-3p mimic+MAP3K12 WT；3)NC-mimic+MAP3K12 MT；4)miR-299-3p mimic+MAP3K12 MT。培养48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，进行各组荧光素酶活性测量。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖：将转染的细胞接种于Corning 96孔板中，每孔接种1×104个细胞，分别于培养24、48和72 h的前4 h每孔加入 20 μL MTT孵育培养，每孔加入150 μL DMSO，振荡8～10 min后，酶标仪上测定吸光度值(A)。

1.2.5 细胞划痕实验和Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭：将转染的细胞接种于Corning 6孔板中，每孔接种1×106个细胞，分别于0和48 h固定显微镜下拍照。同时将单细胞培养悬液，接种于Transwell小室中，每个小室接种1×105个细胞，48 h后固定后置于显微镜下拍照，并记录穿过Transwell小室膜的细胞数。

1.2.6 体外成瘤实验检测肿瘤大小：用4 ～ 8周的BALB/C裸鼠进行体外肿瘤异种移植实验。将1×106个786-O细胞皮下注射到BALB/C裸鼠的上背部。每周测量肿瘤大小，肿瘤体积计算公式为：W2×L/2。

1.2.7 Western blot检测MAP3K12、E-cadherin、vimentin、N-cadherin蛋白的表达：提取总蛋白后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒，根据试剂说明书测定样品的蛋白质浓度，选择的一级抗体：抗MAP3K12抗体(1∶1 000)、E-cadherin 抗体(1∶1 000)、vimentin抗体(1∶1 000)、N-cadherin抗体(1∶1 000)、抗GAPDH抗体(1∶2 000)，然后用二级抗体(1∶5 000)孵育。用Bio-Rad成像分析系统测量每个蛋白质样品。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-299-3p在肾癌细胞系中低表达

miR-299-3p在肾癌细胞系中表达降低，且miR-299-3p在786-O细胞中的表达水平最低(P<0.05)(图1)。因此，进一步选择了786-O细胞系进行后续实验。

*P<0.05 compared with control group(HK-2)图1 miR-299-3p在肾癌细胞系和正常肾上皮细胞系中的表达Fig 1 RT-qPCR analysis of expression levels of miR-299-3p in four cell lines(786-O,769-P, ACHN and A498) and one normal cell line

2.2 miR-299-3p在肾癌细胞中直接靶向调控MAP3K12的表达

在线生物信息学分析预测了miR-299-3p的共同靶基因为MAP3K12(图2A)。荧光素酶报告基因实验结果显示miR-299-3p mimic能显著降低野生型MAP3K12荧光素酶的活性(P<0.05)(图2B)。与阴性对照组相比，miR-299-3p mimic组的MAP3K12表达显著降低(P<0.05)(图2C)。和NC-mimic组和空白对照组相比，转入miR-299-3p mimic后，miR-299-3p表达显著上升(P<0.05)(图2D)，而NC-mimic组和空白对照组的miR-299-3p表达差异无统计学意义。

2.3 miR-299-3p下调MAP3K12表达，调控上皮间质转化(EMT)路径影响肾癌细胞增殖、迁移和侵袭

过表达miR-299-3p可显著抑制786-O细胞增殖能力，而miR-299-3p mimic+MAP3K12共转染则减弱过表达miR-299-3p抑制786-O细胞增殖能力(P<0.05)(图3A)。过表达miR-299-3p可显著抑制786-O细胞迁移、侵袭能力，而miR-299-3p mimic+MAP3K12共转染减弱了由miR-299-3p mimic诱导抑制786-O细胞的迁移和侵袭的能力(P<0.05)(图3B～D)。与对照组相比，miR-299-3p mimic组的肿瘤体积也显著缩少(P<0.05)(图3E)。此外，上调miR-299-3p可导致E-cadherin表达明显上调，同时，N-cadherin、vimentin、MAP3K12蛋白水平显著降低；然而，miR-299-3p mimic+MAP3K12共转染阻止了E-cadherin蛋白的上调，以及下调N-cadherin、vimentin、MAP3K12蛋白(P<0.05)(图3F,G)。

A.online bioinformatics database predicts that the common target gene of miRNA-299-3p was MAP3K12;B.luciferase reporter assay for the luciferase activity of NC-mimic+ MAP3K12 WT,miR-299-3p mimic+MAP3K12 WT,NC-mimic+MAP3K12 MT,miR-299-3p mimic+MAP3K12 MT in 786-O cells;C.expression levels of MAP3K12 in 786-O cells transfected with miR-299-3p mimic,NC-mimic;D.expression levels of miRNA-299-3p in 786-O cells transfected with miR-299-3p mimic,NC-mimic,negative control;*P<0.05 compared with control group图2 miR-299-3p在肾癌细胞786-O中直接靶向调控MAP3K12的表达Fig 2 miR-299-3p directly targeted MAP3K12 expression in 786-O n=3)

3 讨论

新近的研究表明，在不同类型的肿瘤中miRNA具有独特的表达谱，在多种癌发生和发展中具有重要作用[9-10]，促进了miRNA作为肿瘤标志物的预防、诊断、治疗策略的不断深入研究[11-12]。已报道miR-299-3p在恶性间皮瘤细胞中有不同的表达并调节乳腺癌和纤维肉瘤细胞的侵袭性，但是miR-299-3p在肾癌中作用和功能研究尚未见报告。本研究探讨了miR-299-3p 肾癌细胞中的作用和分子机制。RT-qPCR和细胞功能实验结果表明miR-299-3p的表达变化可能同肾癌的发生以及肿瘤的进展具有相关性。

运用多个生物信息学数据库预测了miR-299-3p的共同靶基因为MAP3K12，双荧光素酶报告基因实验验证了在线数据库的预测结果。MAP3K12属于混合谱系激酶(mixed lineage kinase，MLK)的一类，其特征是与丝氨酸/苏氨酸激酶以及其一级结构中的酪氨酸激酶同源，并具有丝氨酸/苏氨酸激酶的功能[13]。已有研究证实芳基烃受体通过促进miR-150-5p调节MAP3K12的表达以抑制前列腺癌的增殖和迁移[14]。本研究证实:miR-299-3p通过靶向调节MAP3K12的表达抑制肾癌786-O细胞系增殖、迁移、侵袭能力。

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤的迁移和侵袭过程中具有重要作用，在这一过程中上皮细胞标志物表达异常，如E-cadherin 蛋白的上调和N-cadherin、vimentin蛋白的下调。Western blot结果证实:miR-299-3p能调控肾癌细胞EMT信号通路相关蛋白的表达。综上所述，miR-299-3p靶向下调MAP3K-12表达并通过调控EMT途径影响肾癌细胞增殖、迁移和侵袭。表明miR-299-3p具有作为肾癌预防、早期诊断、临床治疗、预后评估标志物的潜力。

A.MTT assay showed that miR-299-3p mimic+MAP3K12,miR-299-3p mimic,NC-mimic plasmid regulates the proliferation ability in 786-O cells;B,D.wound healing assay showed that miR-299-3p mimic+MAP3K12,miR-299-3p mimic,NC-mimic regulates 786-O cells’ migration;C.Transwell assays showed that miR-299-3p mimic+MAP3K12,miR-299-3p mimic,NC-mimic regulates 786-O cells’ invasive;E.BALB/c nude mice injected with 786-O cells transfected with miR-299-3p mimic,NC-mimic plasmid subcutaneously and analysis of tumor volume of mice measured every week;F,G.Western blot analysis the expression levels of E-cadherin,N-cadherin,vimentin,and MAP3K12 in 786-O cells transfected with miR-299-3p mimic,NC-mimic,miR-299-3p mimic+MAP3K12;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with miR-299-3p mimic group图3 miR-299-3p靶向下调MAP3K12表达，调控EMT路径，影响肾癌细胞786-O功能Fig 3 miR-299-3p down-regulated MAP3K12 expression，regulated EMT pathway and affected 786-O