阳德全，李常有，崔军威，韦 伟，王少平*

(1.中山大学附属第八医院 肝胆外科，广东 深圳 518000；2.北京大学深圳医院 甲乳外科，广东 深圳 518000)

乳腺癌(breast cancer)是女性常见的恶性肿瘤之一，占女性癌死亡原因的首位[1]。增殖和迁移是导致乳腺癌的不良预后的主要原因，但目前关于乳腺癌的增殖和迁移的机制尚未完全清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码小分子RNA，长度在18～26个核酸的内源性小RNA，其通过与靶基因3’端非编码区域特异性结合的方式调节靶基因的表达[2]，参与多种生物调节途径，如细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等[3]。有研究显示，miRNAs可以通过调控癌基因或抑癌基因表达，参与肿瘤细胞增殖、迁移等生物学过程[4-6]。因此，本研究通过对比分析正常乳腺上皮细胞系MCF-10A与乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中的hsa-miR-4483(Homo sapien-miR-4483)表达水平以及将hsa-miR-4483导入乳腺癌细胞中观察细胞的增殖能力以及迁移力，由于c-myc作为细胞周期的关键蛋白，因此进一步研究hsa-miR-4483是否参于c-myc基因对乳腺癌细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系:人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A、人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231(中国科学院上海生命科学院细胞库)。

1.1.2 药物和试剂:DMEM高糖培养基和澳洲胎牛血清(Gibco公司)；嘌呤霉素(invivogen公司)；转染试剂Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientificals公司)；miDETECT A TrackTMmiRNA RT-qPCR Starter Kit和hsa-miR-4483-mimic(广州锐博公司)；GAPDH一抗及HRP标记的羊抗兔二抗(Abcam公司)；UltraSignal超敏ECL化学发光底物(北京正四柏生物科技有限公司)；MTT(Biosharp公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：DMEM高糖培养基+质量分数为10%澳洲胎牛血清+质量分数为1%的双抗，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。无菌操作，3 d传代培养1次。取传2代，对数增殖，状态良好的细胞用于后续实验。将对数增殖的MCF-7和MDA-MB-231细胞收集，均匀铺于6孔板上，5×105个/孔，放入37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞铺满6孔板后，应用Lipofectamine 2000将mimic及mimic-NC瞬时转染MCF-7与MDA-MB-231细胞。放入37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养6～8 h，将6孔板液体换为完全培养基后继续放入37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.2.2 细胞总RNA的提取及RT-qPCR检测miRNA：用Trizol法提取收集MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231细胞RNA，置于-80 ℃冰箱保存待检。用RNeasy Maxi试剂盒纯化RNA，在NanoDrop 2000c上测定RNA浓度。RNA样品的A260/280值1.8～2.1用于进一步研究。按反转录试剂盒操作说明书进行操作，将提取的每种细胞的总RNA(1 μg)反转录成cDNA。使用罗氏LightCycler 480 real-time PCR系统检测hsa-miR-4483的表达水平。引物如下：hsa-miR-4483上游引物：5′-GGGGUGGUCUGUUGUUG-3′；下游引物：通用引物(miDETECT A TrackTMmiRNA RT-qPCR Starter Kit)；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-ACGCTT CACGAATTTGCGT-3′。RT-qPCR热循环条件为：第1步：95 ℃ 10 min；第2步：95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40个循环；第3步：融解曲线生成。采用相对定量法，以U6为内参，各种细胞中hsa-miR-4483的水平为它与同样本中的 U6的比值为相对表达水平，由公式Flods=2-ΔΔCt计算获得，ΔΔCt为hsa-miR-4483的相对表达水平。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖：对照组和实验组肿瘤细胞以质量分数为10%的胎牛血清高糖培养基配制成2×103个细胞/孔的细胞悬液，96孔板培养(37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱)，分别于24、48和72 h后，加入质量分数为5 g/L的MTT溶液，每孔20 μL，用全波长酶标仪在490 nm处测量各孔的吸光度值。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞迁移：在6孔板瞬时转染细胞48 h后，待各组细胞汇合度95%左右，将细胞加入24孔板，将Transwell小室放入24孔板，先在下室加入600μL完全培养基，Transwell小室加入200 μL无血清的含细胞悬液的培养基，将细胞放入37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养48 h，取出24孔板，弃去上下室培养基，下室加700 μL固定液，4 ℃ 1 h，然后结晶紫700 μL，染色20～30 min。下室加入PBS 700 μL，将Transwell小室放好，明视野照相，每Transwell小室拍照6次，细胞计数取平均值。细胞计数用imageJ软件。

1.2.5 蛋白印迹法检测蛋白表达：各组细胞瞬转48 h，收集各组细胞，用PBS(pH7.4)洗涤细胞，用Pierce裂解液和蛋白酶抑制剂(按质量分数100∶1)混匀miR-4483-mimic组和NC对照组细胞，提取蛋白，并用牛血清蛋白(BSA)作为标准，用BCA标准法测定蛋白质浓度，用质量分数为5%～10% SDS-PAGE分离等份的蛋白质(20 mg)。然后每孔按20 μg上样，恒压80 V，30 min然后110 V，100 min电泳分离后恒流250 mA，120 min转移至PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉TBST常温慢摇封闭1 h，4 ℃下孵育一抗过夜；取出至室温慢摇30 min，TBST洗膜3次，每次15 min，羊抗兔IgG H&L孵育2 h，UltraSignal超敏ECL化学发光底物显影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞中has-miR-4483的相对表达量水平

乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中hsa-miR-4483的相对表达水平明显低于正常细胞MCF-10A(P<0.001)(图1)。

*P<0.001 compared with MCF-10A图1 RT-qPCR验证MCF-10A细胞与MCF-7和MDA-MB-231细胞hsa-miR-4483表达量Fig 1 RT-qPCR verified MCF-10A cell expression with MCF-7 and MDA-MB-231 cell hsa-miR-4483

2.2 导入miR-4483-mimic后进行qPCR验证

导入miR-4483-mimic的MCF-7细胞和MDA-MB-231相对表达水平明显高于对照组的MCF-7和MDA-MB-231(P<0.001，P<0.01)(图2)。

*P<0.01，**P<0.001 compared with MCF-7 NC and MDA-MB-231 NC图2 RT-qPCR验证MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞与导入mimic后的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的hsa-miR-4483表达量Fig 2 RT-qPCR verified MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells with imported MCF-7 cells and MDA-MB-231

2.3 导入miR-4483-mimic对乳腺癌细胞增殖的影响

与对照组比较，miR-4483-mimic促进乳腺癌细胞的增殖。对照组和miR-4483-mimic组MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞相同处理后，与24、48和72 h测量A值，miR-4483-mimic增殖速率高于对照组，24、48和72 h各时间点P<0.001，P<0.01(图3)。

2.4 导入miR-4483-mimic对乳腺癌细胞迁移的影响

乳腺癌细胞的miR-4483-mimic组迁移率明显高于对照组。观测24 h后，MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的miR-4483-mimic组迁移率明显高于对照组(图4A，5A)，由imageJ测量，GraphPad Prism 5.0统计分析(P<0.001，图4B，5B)。可得乳腺癌细胞导入miR-4483-mimic后迁移率高于对照组。

2.5 导入miR-4483-mimic乳腺癌细胞蛋白印迹法检测

与对照组相比，导入miR-4483-mimic后，通过imagej测量吸光度值和GraphPad Prism 5.0软件统计数据，可以得到MCF-7和MDA-MB-231蛋白水平平均显著上调(图6，7)。

2.6 hsa-miR-4483的增殖曲线

has-miR-4483促进乳腺癌发展，无论患者有无淋巴结转移，hsa-miR-4483均促进死亡，因此淋巴结对hsa-miR-4483促进细胞周期无影响(图8)。

A.hsa-miR-4483 affected the proliferation curve of MCF-7 cells;B.hsa-miR-4483 affected the proliferation curve of MDA-MB-231 cells;*P<0.01，**P<0.001 compared with MCF-7 control and MDA-MB-231 control图3 hsa-miR-4483影响MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖曲线Fig 3 hsa-miR-4483 affected the proliferation curve of MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer n=3)

A.mimic group and NC group migration map at 24 hours of MCF-7(×200)；B.statistical analyses chart of repeated three times;*P<0.001 compared with MCF-7 NC group图4 MCF-7 细胞hsa-miR-4483组和 NC组的Transwell小室法检测及统计分析Fig 4 Transwell assay of MCF-7 cells and statistical analysis of hsa-miR-4483 group and NC n=3)

A.mimic group and NC group migration map at 24 hours of 231 cell(×200)；B.statistical analyses chart of;*P<0.001 compared with MDA-MB-231 NC group图5 231细胞hsa-miR-4483组和 NC组的Transwell小室法检测及统计分析Fig 5 Transwell assay of 231 cells and statistical analysis of hsa-miR-4483 group and NC n=3)

A.Western blot verifies MCF-7 c-myc expression;B.Western blot results in the absorbance value measurement statistics*P<0.01 compared with MCF-7 NC group图6 Western blot验证MCF-7 c-myc表达量Fig 6 Western blot verified MCF-7 the expression level of c-myc

A.Western blot verifies MDA-MB-231 c-myc expression;B.Western blot results in a absorbance measurement chart;*P<0.01 compared with MCF-7 NC and MDA-MB-231 NC group图7 Western blot验证MDA-MB-231 c-myc表达量Fig 7 Western blot verified MDA-MB-231 the expression level of c-myc

3 讨论

乳腺癌为临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率在不断的升高且有向年轻化的发展趋势，这对乳腺癌的临床防治造成极大的困难[7]。miRNA是近年来发现的一类长度为18～26个核苷酸的内源性小RNA，有研究表明，miR-29[8]、miR-241[9]、miR-320[10]等与乳腺癌的发生发展存在相关性。

众所周知，miRNA主要是通过结合mRNA的3’UTR区，和转录后调控[11]，要体现在一方面可与沉默核糖蛋白复合物结合，通过序列完全互补的方式降解目的蛋白，另一方面可通过非完全互补结合发挥转录后调控。TargetScan软件能够预测 miRNA 的靶基因及其结合位点。本实验采用TargetScan软件预测出c-myc可能是has-miR-4483的靶点。

c-myc基因已经被研究多年。c-myc基因在肺癌中的高表达[12]。随后发现c-myc基因在多种肿瘤中被激活[13]。c-myc基因在30%～50%的高分化乳腺癌中高表达[14]。

hsa-miR-4483作为新发现的miRNA，目前在乳腺癌细胞的表达以及作用尚不清楚。本研究首先采用RT-qPCR，检测了正常细胞MCF-10A、乳腺癌细胞MCF-7和乳腺癌细胞MDA-MB-231中hsa-miR-4483均为低表达。为了进一步明确hsa-miR-4483对乳腺癌细胞的增殖和迁移的影响，将miR-4483-mimic和miR-4483-nc转染MCF-7和MDA-MB-231细胞。通过MTT实验，发现hsa-miR-4483对乳腺癌细胞有促进增殖的作用；通过Transwell迁移实验发现hsa-miR-4483对乳腺癌细胞的迁移有促进作用。因此hsa-miR-4483对乳腺癌细胞的增殖和迁移有促进作用。通过Western blot实验证明，hsa-miR-4483能够有效的作用于c-myc蛋白。

控制乳腺癌的扩散和转移是中晚期乳腺癌临床治疗上的难题。本实验证明，hsa-miR-4483促进乳腺癌的增殖和转移，c-myc作为细胞周期的关键蛋白，本文验证hsa-miR-4483能够促进其增殖。因此，抑制hsa-miR-4483的药物就有可能在细胞周期中起到调控c-myc蛋白的作用，可能抑制乳腺癌的增殖和转移，从而提高乳腺癌的治愈率。

A.has-mir-4483 proliferation curve;B.lymph nodes negative proliferation curve of hsa-miR-4483;C.lymph nodes positive proliferation curve of hsa-miR-4483图8 hsa-miR-4483增殖曲线Fig 8 hsa-miR-4483 proliferation curve