于 锐，张新茹，王丹丹，何 平，白 瑜，田 密，张蓓茹*

(1.中国医科大学附属盛京医院 肾内科,辽宁 沈阳 110004；2.沈阳市苏家屯区中心医院 肾内科,辽宁 沈阳 110101)

近年来随着放射诊断技术的进展与介入治疗的广泛应用，碘对比剂(iodine contrast)使用明显增加，尽管碘对比剂本身已不断的改良，但对比剂肾病(contrast-induced nephropathy，CIN)仍频频发生。研究表明肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)不仅可以作为急慢性肾损伤的早期生物学标志物，而且也参与了肾脏病的损伤与修复过程[1]。本研究团队在前期研究中发现，对比剂肾病大鼠模型尿KIM-1水平在早期即明显增加，可作为对比剂肾病早期的生物学标志物[2]，但KIM-1是否在对比剂肾病的发展中具有病理作用尚不明确。因此，本实验通过体外培养人肾小管上皮细胞系HK-2，初步探索KIM-1是否参与对比剂肾病HK2细胞凋亡及其可能途径，明确KIM-1在碘对比剂所致HK2细胞损伤中可能的病理作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

人肾小管上皮细胞系HK-2以及KIM-1-siRNA、MCP-1引物(中国广州吉妮欧公司)；DMEM/F12培养液、胎牛血清、PBS磷酸盐缓冲液和Opti-MEM(Hycloe公司)；胰蛋白酶(Gbico公司)；DEMSO和HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(Sigma-Aldrich公司)；青霉素-链霉素溶液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、细胞膜蛋白与胞质蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、超敏ECL化学发光试剂盒、annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和ROS检测试剂盒(北京碧云天生物技术公司)；LipofecamineTM2000(Invitrogen公司)；反转录试剂盒和real-time PCR相关试剂(TaKaRa公司)；碘海醇(iohexol)(通用电气药业上海有限公司)；KIM-1抗体(Abcam公司)；GAPDH抗体(Proteintech Group公司)；SOD和MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；Bax和Bcl-2抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及转染:以含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养液，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养HK-2细胞，取3～5代对数增殖期细胞进行实验，各组实验重复3次。进行细胞转染时以5×105个细胞/孔将细胞接种于6孔板，细胞至70%～80%汇合时，更换无血清培养液同步化，依照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。

1.2.2 细胞的分组:用10%胎牛血清的DMEM/F12培养液将35 g/100 mL的碘海醇稀释成与体内使用对比剂后肾小管腔内浓度一致的75 mg/mL工作液，处理HK-2细胞不同时间点(0、0.5、2、4和12 h)[3]，观察不同时间点KIM-1的表达情况，以确定本实验的最佳干预时间点。在观察KIM-1在对比剂所致HK-2细胞损伤中的病理作用实验中，将细胞分为对照组(A)，对比剂组(B)，对比剂+空载组(C)和对比剂+KIM-1-siRNA组(D)，75 mg/mL的碘海醇均在细胞转染siRNA后24 h加入，加入后2 h收集细胞,并进行进一步实验。

1.2.3 Western blot检测KIM-1蛋白:收集不同组细胞，按照提取试剂盒说明书提取蛋白，BCA蛋白定量试剂盒法测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液并煮沸，取等量蛋白进行SDS-PAGE，进行半干法转膜和5% BSA封闭1 h，按照抗体说明书推荐比例对一抗进行稀释，在4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次后加入ECL发光液显影，Image J图像分析系统进行吸光度值分析。

1.2.4 Annexin V-FITC检测细胞凋亡：收集不同组细胞1 000×g离心5 min，弃上清，用PBS重悬细胞并计数，取5×104个重悬的细胞，再次1 000×g离心5 min，弃上清，加入195 μL annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入5 μL annexin V-FITC混匀，室温避光孵育10 min。1 000×g离心5 min，弃上清，加入190 μL annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，混匀冰浴放置，随即进行流式细胞仪检测。

1.2.5 MDA、SOD和ROS含量的测定：测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)时，收集不同组细胞上清液，分别采用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法，按照试剂盒说明书操作步骤进行操作。而测定活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量时，收集不同组细胞，采用流式细胞计量术利用荧光探针DCFH-DA按照试剂盒说明书步骤进行ROS测定。

1.2.6 RT-qPCR检测MCP-1：收集不同组细胞,按照总RNA提取试剂盒说明书步骤提取总RNA，紫外分光光度仪测定RNA的浓度。取500 ng RNA按照cDNA合成试剂盒说明书步骤进行反转录反应获取cDNA。随后进行PCR扩增，引物设计如下：MCP-1上游引物：5′-GCAGAAGTGGGTTCAGGATT-3′，下游引物：5′-CAAGTCTTCGGAGTTTGGGT-3′。扩增完成后通过2-△△Ct法计算MCP-1的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 碘海醇导致HK-2细胞KIM-1表达增加

给予75 mg/mL碘海醇处理HK-2细胞不同时间，在2 h时KIM-1蛋白表达量最多，在4和12 h时KIM-1表达有所下降(图1)。根据该结果确定碘海醇处理HK-2细胞2 h作为进一步实验干预时间。

2.2 靶向KIM-1基因siRNA转染使碘海醇所致HK-2细胞KIM-1表达减少

给予75 mg/mL碘海醇处理HK-2细胞2 h，KIM-1蛋白表达明显增多，但靶向KIM-1基因siRNA转染后能够有效抑制KIM-1的表达(图2)。

*P<0.05 compared with other group图1 75 mg/mL碘海醇处理HK-2细胞不同时间KIM-1蛋白表达情况Fig 1 Expression of KIM-1 protein in HK-2 cells treated with iohexol at different

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group图2 75 mg/mL碘海醇处理HK-2细胞2 h时各组细胞KIM-1蛋白表达情况Fig 2 Expression of KIM-1 protein in HK-2 cells treated with iohexol for 2 hours

2.3 靶向KIM-1基因siRNA转染能够减轻碘海醇所致HK-2细胞的凋亡

HK-2细胞给予碘海醇处理2 h后，HK-2细胞发生明显凋亡，而给予靶向KIM-1基因siRNA转染后，HK-2细胞凋亡程度明显减轻(P<0.05)(图3)。碘海醇使Bax表达增加，Bcl-2表达降低，而靶向KIM-1基因siRNA转染后，相比较空载组Bax表达下降，而Bcl-2蛋白表达上升(P<0.05)(图4)。

2.4 KIM-1可能通过促进氧化应激和炎性反应参与碘海醇所致HK-2细胞凋亡

碘海醇处理HK-2细胞2 h后(图5)，与对照组比较，MDA、ROS水平明显上升，而SOD水平下降，同时MCP-1表达增加(P<0.05)。而给予靶向KIM-1基因siRNA转染后，上述改变均得到部分纠正，在碘海醇处理下，siRNA组较空载组HK-2细胞MDA、ROS水平有所下降，SOD水平上升，同时MCP-1表达下降(P<0.05)。

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group图3 流式细胞计量术评估HK-2细胞凋亡程度Fig 3 Assessment of apoptotic degree of HK-2 cells by flow

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group图4 Western blot方法检测Bax和Bcl-2蛋白表达评估HK-2细胞凋亡程度Fig 4 Expression of Bax and Bcl-2 protein was detected by Western blot to evaluate the apoptotic degree of HK-2 n=3)

A.control;B.iohexol;C.iohexol+vehicle;D.iohexol+KIM-1-siRNA;*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with C group图5 MDA、ROS和SOD评估HK-2细胞氧化应激，MCP-1评估HK-2细胞炎性反应Fig 5 MDA,ROS and SOD assessed oxidative stress in HK-2 cells,and MCP-1 assessed inflammatory response in HK-2 n=3)

3 讨论

KIM-1是新近发现的在肾小管上皮细胞表达的一种 Ⅰ 型跨膜蛋白。目前可以通过检测尿液中KIM-1的水平来反映肾小管损伤程度，在临床中也将KIM-1作为各种原因引起的急性肾小管损伤的早期敏感生物标志物[4-5]。对比剂肾病是临床中常见的急性肾损伤的病因，目前仍然以肌酐水平的升高来诊断，笔者团队在动物模型中证实KIM-1是反映对比剂肾病(CIN)早期生物标志物[3]。在临床中也得到同样的结论[6]。

KIM-1在肾脏的生理功能以及病理作用仍不明确，但是越来越多的证据支持KIM-1的早期表达不仅仅是反映肾小管急性损伤的生物标志物，而是参与了肾脏疾病的进展[7-8]。在一项纳入4 739例患者，平均随访16.6年的研究中发现基线血清KIM-1水平与eGFR下降速率呈明显正相关，而且伴随着基线KIM-1水平的增加，在随访期间因肾功能衰竭住院风险也明显增加[9]。研究发现双侧缺血/再灌注急性肾损伤大鼠模型尿KIM-1水平与进展至慢性期肾小管间质纤维化的程度呈密切相关性[10]。建立持续在肾小管上皮细胞表达KIM-1的转基因小鼠，发现即使在没有外界任何促进肾小管间质损伤的因素存在下，4周后转基因小鼠自发出现肾脏炎性反应和肾小管间质纤维化，且进行性加重[11]。本研究中也进一步证实在碘海醇刺激下KIM-1表达增加不仅仅是细胞损伤的生物标志物，而且参与了细胞凋亡的过程，具有重要的病理作用。

KIM-1通过何种途径参与肾脏病机制尚不十分明确，促进肾脏局部炎性反应被认为是重要的机制之一[11]。近些年研究提示炎性反应过程也参与了对比剂所致的肾损伤过程[12]。在本研究中主要通过评估KIM-1表达的抑制对碘海醇所致HK-2细胞氧化应激和炎性反应的影响进一步探讨KIM-1参与对比剂肾病发病的可能机制，结果证实KIM-1可能部分通过促进炎性反应进而参与对比剂所致肾脏损伤过程。

综上所述，本研究初步探讨了在对比剂所致肾小管上皮细胞损伤过程中KIM-1的病理作用，研究结果提示KIM-1在对比剂干预下的高表达可能通过促进肾小管上皮细胞的氧化应激和炎性反应而参与细胞损伤过程。这一研究结果更进一步证实了KIM-1不仅仅是对比剂肾病(CIN)的早期生物标志物，而且参与到病理过程中，对KIM-1进行干预可能成为临床预防或治疗对比剂肾病的有效手段，为将来有效防治对比剂肾病(CIN)提供理论基础。