张黎仙，林 堃

1.福建省莆田市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心，福建莆田 351100；2.莆田学院附属医院产前诊断中心，福建莆田 351100

珠蛋白生成障碍性贫血又称为地中海贫血，主要是遗传性α珠蛋白基因缺陷或者β珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白链缺如或合成不足所引起的溶血性贫血或病理状态，所有类型的珠蛋白生成障碍性贫血都是常染色体隐性遗传，并且可能发生不同的异常等位基因杂合的情况。重型α珠蛋白生成障碍性贫血可导致妊娠高血压综合征、死胎、产后大出血等，重型β珠蛋白生成障碍性贫血可导致死胎、新生儿死亡或出生后进行性贫血[1]。珠蛋白生成障碍性贫血在我国主要高发于南方地区，尤其是在广东、广西、海南、福建发病率较高[2-3]。因此，为了深入了解莆田市珠蛋白生成障碍性贫血基因变异情况，本研究对3 151例疑似珠蛋白生成障碍性贫血基因检测结果进行分析，进一步探索莆田市珠蛋白生成障碍性贫血的诊断方案。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年1月至2021年10月在莆田学院附属医院进行珠蛋白生成障碍性贫血基因检测的3 151例疑似珠蛋白生成障碍性贫血者作为研究对象，其中男647例、女2 504例，年龄1个月至74岁。纳入标准：(1)夫妇双方只要有一方平均红细胞体积(MCV)<80 fL和(或)平均血红蛋白含量(MCH)<27 pg，视为初筛阳性，双方需进行血红蛋白(Hb)电泳检测；夫妇双方MCV、MCH或Hb电泳结果阳性时，双方行珠蛋白生成障碍性贫血基因检测(属于珠蛋白生成障碍性贫血防控试点项目)。(2)筛查血红蛋白电泳阳性，临床上怀疑珠蛋白生成障碍性贫血的患者。(3)小细胞低色素性贫血，排除缺铁性贫血，临床上又高度怀疑珠蛋白生成障碍性贫血的患者。本研究经莆田学院附属医院伦理委员会批准，所有研究对象或其家属对本研究均知情同意。

1.2仪器与试剂 血常规检测系统采用深圳迈瑞全自动血液分析仪BC5800及其配套试剂；血红蛋白电泳采用法国Sebia全自动毛细管电泳仪CAPILLARYS2及其配套试剂；PCR基因扩增仪采用美国伯乐T100，试剂采用潮州凯普公司提供检测的试剂盒对标本进行基因诊断。

1.3方法

1.3.1基因提取 抽取研究对象EDTA-K2抗凝外周血2 mL，采用广东潮州凯普公司提供的基因提取试剂盒提取DNA。

1.3.2珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断 使用广东潮州凯普公司提供的珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断试剂盒，采用跨越断点PCR法(Gap-PCR)检测3种缺失型α珠蛋白生成障碍性贫血基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3种突变型α珠蛋白生成障碍性贫血基因(CS、QS、WS)和17种β珠蛋白生成障碍性贫血基因(CD41-42/N、IVS-Ⅱ-654/N、-28/N、CD71-72/N、CD17/N、CD26/N或BE/N、CD43/N、-29/N、-30/N、CD31/N、-32/N、CD14-15/N、IVS-Ⅰ-1/N、IVS-Ⅰ-5/N、CAP+40-43/N、CD27/28/N、Int/N)。

1.3.3珠蛋白生成障碍性贫血基因测序 经上述α及β珠蛋白生成障碍性贫血基因检测未发现致病性突变的，而临床上高度怀疑珠蛋白生成障碍性贫血的患者，进行相应α或β基因序列测定，检测中国型Gγ+(Aγδβ)0和东南亚型HPFH基因缺失等，通过高通量测序检测珠蛋白生成障碍性贫血基因序列，分析是否存在检测范围外的突变和缺失。

1.4统计学处理 采用SPSS18.0软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示。

2 结 果

2.1基因检测结果 3 151例疑似珠蛋白生成障碍性贫血携带者，确诊1 517例，检出率为48.14%。其中 α珠蛋白生成障碍性贫血948例(62.49%)，β珠蛋白生成障碍性贫血553例(36.45%)，αβ复合珠蛋白生成障碍性贫血16例(1.05%)。

2.2α珠蛋白生成障碍性贫血基因型分析 对检出的948例α珠蛋白生成障碍性贫血患者的基因型进行具体分类，结果发现共检出14种基因组合类型，其中占比较高的基因型为--SEA/αα(75.21%)、-α3.7/αα(13.92%)；检出α珠蛋白生成障碍性贫血纯合子3例，基因型分别为-α3.7/-α3.7、ααQS/ααQS、-α4.2/-α4.2；双重α杂合子共检出5种基因型，其中-α3.7/--SEA占有相对较高的比例(2.11%)。另外，通过基因测序在莆田市首次检出2例--THAI/αα罕见珠蛋白生成障碍性贫血基因型。各种基因突变型及构成比见表1。

表1 α珠蛋白生成障碍性贫血基因型及构成比

2.3β珠蛋白生成障碍性贫血基因型分析 对检出的553例β珠蛋白生成障碍性贫血患者的基因型进行具体分类，结果发现共检出14种基因组合类型，其中占比较高的基因型为βIVS-Ⅱ-654/βN(48.28%)、βCD41-42/βN(27.31%)。检出多种少见组合类型，如βIVS-Ⅱ-654/βCD17、βCD41-42/βCD17、βCD41-42/β-28。各基因型及构成比见表2。

表2 β珠蛋白生成障碍性贫血基因型及构成比

2.4αβ复合珠蛋白生成障碍性贫血基因型检测结果 检出αβ复合珠蛋白生成障碍性贫血16例，包括8种类型，其中占比较高的基因型为-α3.7/αα+βCD41-42/βN及--SEA/αα+βIVS-Ⅱ-654/βN。各基因型及构成比见表3。

表3 αβ复合珠蛋白生成障碍性贫血基因型及构成比

3 讨 论

成人主要血红蛋白含两条α珠蛋白链和两条β珠蛋白链，具有携氧功能，健康人自父母双方各继承2个α珠蛋白基因和1个β珠蛋白基因，合成正常量的α和β珠蛋白链，若自父母继承了异常的珠蛋白基因，则造成α链或β链合成障碍从而导致珠蛋白生成障碍性贫血。根据缺乏的珠蛋白种类不同，分为α珠蛋白生成障碍性贫血和β珠蛋白生成障碍性贫血。α珠蛋白生成障碍性贫血可分为静止型(1个α基因异常)、轻型(2个α基因异常)、中间型(3个α基因异常即HbH病)以及重型(4个α基因异常，即Hb Bart′s胎儿水肿综合征)；β珠蛋白生成障碍性贫血也可分为轻型、中间型和重型。珠蛋白生成障碍性贫血是我国南方地区围生儿死亡的主要原因之一，重型α珠蛋白生成障碍性贫血围生儿多胎死腹中或产后几小时死亡；重型β珠蛋白生成障碍性贫血患者常伴有严重的贫血症状，整个生命周期都需要依赖定期输血和去铁治疗维持生命，给家庭和社会带来沉重的经济负担和精神压力[4]。福建省是我国珠蛋白生成障碍性贫血高发省份之一，目前关于福建省珠蛋白生成障碍性贫血的研究资料相对较少。2013年徐两蒲等[5]报道，福建人群珠蛋白生成障碍性贫血携带率高达4.41%。随着东南沿海地区与两广地区交流互通，人口流动增加，珠蛋白生成障碍性贫血基因变异类型趋向复杂化，为了完善、更新福建莆田地区珠蛋白生成障碍性贫血的流行病学资料，促进优生优育，本研究对在莆田学院附属医院进行珠蛋白生成障碍性贫血检测的人群做一个基因变异类型频率分析。

本研究共检出15种α珠蛋白生成障碍性贫血突变基因型，占比最高的基因型为--SEA/αα，其次为-α3.7/αα。这与本课题组2016年的研究成果相符[6]，但是新发现基因类型多了7种，体现了本地区突变类型复杂多样性的特点。莆田市α珠蛋白生成障碍性贫血与本省其他市相比主要基因型相似[7-9]，与广东[10]、广西[11]、云南[12]、湖北武汉[13]等地的主要基因型也一致，但是与揭秋玲等[14]报道的海南省α珠蛋白生成障碍性贫血主要以-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα为主不同，差异稍大。由此可见，大部分南方地区α珠蛋白生成障碍性贫血基因型都是以--SEA/αα缺失型为主。同时，本次研究还发现，ααCS/αα在莆田市有较高的检出率，提示CS位点可能是莆田市α珠蛋白生成障碍性贫血的主要基因突变点。本研究共检出β珠蛋白生成障碍性贫血突变基因型14种，主要基因突变类型最常见的是βIVS-Ⅱ-654/βN，其次为βCD41-42/βN，分别占 β珠蛋白生成障碍性贫血基因型的48.28%、27.31%，另外检出多种少见组合类型，如βIVS-Ⅱ-654/βCD17、βCD41-42/βCD17、βCD41-42/β-28，丰富了莆田市珠蛋白生成障碍性贫血基因突变谱。β珠蛋白生成障碍性贫血主要突变基因型与福建省其他市以往相关报道一致[15-16]，但与其他研究报道的广东[10]、海南[14]的前3位基因型(βCD41-42/βN、βIVS-Ⅱ-654/βN、β-28/βN)，广西[11]的前3位基因型(βCD41-42/βN、βCD17/βN、β-28/βN) ，云南[12]的前3位基因型(βCD26/βN、βCD17/βN、βCD41-42/βN)，四川[17]的前3位基因型(βCD17/βN、βCD41-42/βN、βIVS-Ⅱ-654/βCD17)相比差异甚大，进一步佐证了β珠蛋白生成障碍性贫血具有更明显的区域差异性。αβ复合珠蛋白生成障碍性贫血共检出16例，共有8种组合类型，以-α3.7/αα+βCD41-42/βN居多。α珠蛋白生成障碍性贫血基因型以--SEA/αα为主，β珠蛋白生成障碍性贫血基因型以βIVS-Ⅱ-654/βN为主，按照遗传定律αβ复合珠蛋白生成障碍性贫血基因型应以--SEA/αα+βIVS-Ⅱ-654/βN为主，而在本次研究中仅排第2位，这可能与本次分析统计的αβ复合珠蛋白生成障碍性贫血数量不多有关。

现今主流的珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断试剂盒采用已知探针捕获，导流杂交的原理，仅检测23种常见珠蛋白生成障碍性贫血基因突变类型，即3种常见α珠蛋白生成障碍性贫血缺失型基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3种α突变型基因(αWS、αQS、αCS)以及17种β珠蛋白生成障碍性贫血基因点突变。然而，珠蛋白生成障碍性贫血具有广泛的遗传异质性，其基因突变类型繁多，在临床工作中经常遇到一些高度可疑的珠蛋白生成障碍性贫血患者使用常规方法却得到未检出突变的正常结果。吕荣钰等[18]研究也发现，就算常规基因检测阴性的人群中仍有1.8%的常规基因和 5.6%的罕见基因突变漏检。莆田市珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断范围囿于常规检测的23种，莆田市高发的罕见珠蛋白生成障碍性贫血类型是否存在未知新发突变目前尚不可知。随着高通量技术(NGS)的发展以及生物信息学与大数据科学的交叉应用，在NGS平台进行珠蛋白生成障碍性贫血基因序列分析成为可能。近年来研究也证实了NGS不仅可用于珠蛋白生成障碍性贫血基因筛查，还能发现较为罕见的新基因型[19]。徐湘民教授团队在《EBio Medicine》上报道我国南方5省2万人群的珠蛋白生成障碍性贫血基因联合筛查结果，结果表明基于NGS的珠蛋白生成障碍性贫血基因检测能发现更多的致病或疑似致病变异，其中12.1%的变异为传统珠蛋白生成障碍性贫血检测方式无法检测到[20]。本研究针对可疑假阴性标本进行DNA序列分析，通过测序检出2例以--THAI/αα罕见基因型，不在常规试剂盒检测范围内，为莆田市首次报道。福建省泉州和三明地区也曾检出过该罕见基因型[21-22]，说明该罕见珠蛋白生成障碍性贫血基因型在福建省内相对多发。因此，当临床遇到可疑珠蛋白生成障碍性贫血但是常规检测阴性，应进行罕见珠蛋白生成障碍性贫血基因型检测，通过DNA序列分析判断是否为罕见珠蛋白生成障碍性贫血基因突变型，或存在新发突变，探索莆田市罕见珠蛋白生成障碍性贫血类型、分布情况及遗传特点，然后针对高发的罕见珠蛋白生成障碍性贫血基因设计特异探针，扩大莆田市常规珠蛋白生成障碍性贫血基因的检测范围，提升罕见珠蛋白生成障碍性贫血识别能力，为罕见珠蛋白生成障碍性贫血基因突变携带者提供更完善的诊断方案。

本研究全面探索莆田市珠蛋白生成障碍性贫血突变类型及分布特征，完善珠蛋白生成障碍性贫血基因突变图谱(含常见珠蛋白生成障碍性贫血基因缺陷、罕见珠蛋白生成障碍性贫血和新发突变)，为珠蛋白生成障碍性贫血诊断提供最新的实验依据，今后将制订个性化的珠蛋白生成障碍性贫血筛查诊断方案，降低莆田市珠蛋白生成障碍性贫血的漏筛风险。