何洪标，梁俏敏，郑曙光

广东省中山市陈星海医院(中山 5281415)

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种高发病率、高病死率的恶性肿瘤。据调查研究报告，我国患结直肠癌病的人数以及此疾病死亡人数逐年增加，这与人们的饮食习惯密切相关，目前大家比较热衷于追求刺激味蕾的重口味食物。结直肠癌的治疗手段有化疗、放疗以及手术等[1]。结直肠癌高发于老年群体，但是由于老年患者一系列身体机能的衰退，对治疗的要求更高，目前现有的治疗手段难以满足老年人治疗的要求。因此研究出一种更好的治疗手段迫在眉睫[2]，故本研究提出结直肠锯齿状息肉病相关通道蛋白表达水平对患者病情的影响，为临床研究提供依据。

资料与方法

1 一般资料 2015年3月至2019年8月，对中山市陈星海医院消化内科85例结直肠锯齿状息肉病患者及健康体检中心85例健康居民进行了临床调查研究。入组患者均签署研究同意书。本研究获得中山市陈星海医院医学伦理委员会批准。直肠锯齿状息肉病诊断参照WHO公布的锯齿状息肉综合征诊断标准：近端结肠中发现至少有5个锯齿状病变，并且其中至少2个锯齿状息肉直径超过10 mm；有SPS家族史并发现存在1个及以上的结直肠锯齿状息肉；整个结直肠肠腔中发现超过20个以上的锯齿状息肉。符合上述三个指标任意一个即可诊断。共同纳入标准：无重要脏器功能障碍；无肿瘤史；无消化系统手术史；临床资料完整；Karonfsky评分超过60分。共同排除标准：哺乳期妇女、孕妇或其他特殊情况者；近30 d有接受消化系统系统性治疗的患者；糖尿病、高血脂症、高血压等慢性疾病者。健康组85例，男51例，女34例；年龄34～55岁，平均(50.12±4.02)岁；BMI(22.81±0.64)kg/m2。疾病组85例，男53例，女32例；年龄34～55岁，平均(52.05±3.02)岁；BMI(22.79±0.21)kg/m2；病程10～21个月，平均(14.25±3.28)个月。两组患者均衡性好，可比性高。

2 检测方法 对两组相关通道蛋白采用免疫组化方法进行定性检测，具体包括P-gP(P-糖蛋白，P - glycoprotein)；Survivin(凋亡抑制蛋白，Apoptotic inhibitor protein)；HSP70(重组人HSP70蛋白，Recombinant human HSP70 protein)；EHD2(EHD2人源全长重组蛋白，EHD2 human full-length recombinant protein)。在内镜辅助下取病理标本，将切片脱蜡至水，滴加3%过氧化氢液室温下避光孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性。而后将切片浸入枸橼酸盐缓冲液(0.01 mol/L)中，入微波炉中修复8 min，PBS冲洗3 min×3次，滤纸吸干PBS液。滴加正常山羊血清，室温下孵育15 min，中和非特异性反应。滴加BRAF(1∶100浓度)、EphB2兔抗人特异性抗体(1∶150浓度)，入湿盒内4℃冰箱过夜。次日滴加生物素标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育20 min。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温下孵育15 min。DAB底物显色，镜下控制反应时间，苏木精复染，盐酸(浓度1.0%)酒精分化5 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。阳性染色均为棕黄色(或棕褐色颗粒)，多集中于细胞质中，少量在细胞膜。

3 结果判定 按染色强度评分：无染色(0分)，淡黄色(1分)，棕黄色(2分)，棕褐色(3分)。按阳性细胞所占百分比评分：<5.0%(0分)、5.0%～25.0%(1分)、26.0%～50.0%(2分)、51.0%～75.0%(3分)、>75%)4分。两项评分的乘积为每张切片组织染色结果，最终根据乘积结果进行定性判定，>3分记为阳性，≤3分则为阴性。

4 统计学方法 选用SPSS21.0统计学软件进行分析。正态分布的计量资料采用均值±标准差表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 两组相关通道蛋白检出情况比较 两组对象四种通道蛋白(P-gP、Survivin、HSP70、EHD2)检出情况比较差异有统计学意义(P<0.05)，疾病组患者通道蛋白检出率均高于对照组。见表1。

表1 两组对象相关通道蛋白检出情况比较(例)

2 不同情况或病情疾病组患者相关通道蛋白检出情况比较 P-gP检出情况比较，性别、年龄、息肉直径、分化程度、浸润深度、临床分期对其影响有统计学意义(P<0.05)。Survivin检出情况比较，年龄、息肉直径、浸润深度、临床分期对其影响有统计学意义(P<0.05)。HSP70检出情况比较，性别、分化程度对其影响有统计学意义(P<0.05)。EHD2检出情况比较，年龄对其影响有统计学意义(P<0.05)。见表2。

讨 论

结直肠锯齿状息肉包括传统锯齿状腺瘤、增生性息肉以及SSP/P，其特点为恶性潜能的组织学发生病变。SSP/P是散发性结直肠癌癌前病变的重要标志。结直肠锯齿状息肉病变的病理学特点以及内镜的表现因病变类型而异，组织学特征是确诊此疾病的重要手段[3]。锯齿状息肉病综合征患者患结直肠癌的概率极高，患者通常具有数个锯齿状息肉。结直肠癌在临床上较为常见，在我国经济飞速发展的形势下，人们的经济水平日益提高，生活质量也发生了质的飞跃，导致人们的生活方式发生了转变，人们更倾向于追求味蕾的刺激，而结直肠癌作为消化系统肿瘤发病率呈现逐年增长的趋势[4]。

经过研究发现疾病组患者四种通道蛋白(P-gP、Survivin、HSP70、EHD2)检出率均高于对照组，差异均有统计学意义。P-gP检出情况比较，性别、年龄、息肉直径、分化程度、浸润深度、临床分期对其影响有统计学意义。Survivin检出情况比较，年龄、息肉直径、浸润深度、临床分期对其影响有统计学意义。HSP70检出情况比较，性别、分化程度对其影响有统计学意义。EHD2检出情况比较，年龄对其影响有统计学意义。分析患者不同临床特征对各通道蛋白表达含量的影响，性别因素可能与结直肠锯齿状息肉流行特征有关，该病在男女人群中的发病率本身存在一定固有差异，这种流行趋势可能一定程度影响了多项通道蛋白的检出含量。同时，由于本研究筛选的通道蛋白为疾病特征性蛋白，息肉直径较大、分化程度和浸润深度相对较高、临床分期级别较高的临床患者，其通道蛋白表达含量相对较高。也可能与病情较重的患者，其内环境紊乱更为严重，原发病灶持续存在进而影响了通道蛋白的表达有关，具体原因还需进一步深入分析。

表2 不同情况或病情疾病组患者相关通道蛋白检出情况比较(例)

Survivin是一种很好的治疗候选基因，它可以作为诊断肿瘤的标志物。它在细胞凋亡时发挥重要的作用，同时它也参与肿瘤细胞生长、凋亡和放疗抵抗等多种功能调节[5]。Survivin蛋白与结直肠癌的演进和转移呈正相关的关系，在肿瘤组织中Survivin蛋白会处于极高表达的状态，它对血管的生成起促进作用，临床上将Survivin蛋白又称为肿瘤细胞的存活素，因为这种蛋白具有增强肿瘤细胞的侵袭、耐药性以及增殖等能力。Survivin蛋白可以通过作用于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3以及Caspase-9从而对肿瘤的恶化进程起促进作用。同时它能够对肿瘤细胞的凋亡起到抑制作用[6-8]。 Survivin蛋白除与抑制凋亡和保护细胞存活外，还参与肿瘤血管形成，对肿瘤的浸润、转移等有关[9]。Survivin蛋白能够促进肿瘤细胞大量增殖和瘤细胞转移的发生。Survivin通道蛋白的表达能够随着结直肠癌患者血清中肿瘤标志物CEA的含量增多而增加。因此造成疾病组患者Survivin通道蛋白检出率均高于对照组。P-gP是一种能量依赖性的跨膜蛋白，它是由MDR-1基因编码的。P-gp蛋白阳性率的高低受淋巴结转移和TNM分期进程的影响，如果检出P-gP蛋白阳性率出现升高趋势就提示P-gp蛋白高水平的表达。P-gp蛋白与肿瘤细胞的多药耐药性有一定的关系，在能量充足的前提下，它能够依靠“药泵”的功能将各种化合物转运出细胞外，例如与化疗有关的药物[10-14]。P-gP可以参与信号通路,比如它可以阻断一些信号通路，如P13K/AKT信号通路，从而可以使细胞的药物敏感性得到增强。在临床上P-gP通常作为判断肿瘤耐药性以及此疾病化疗效果的标志物。

HSP70是一种协同免疫的蛋白质。HSP70在正常情况下呈现低水平表达。当机体受到高温刺激以及处于应激状态时会导致HSP70的合成迅速增加以提高机体的抗应激能力。HSP70与细胞的多个环节密切相关，如细胞的生长、分化等。据资料显示HSP70可能与患者出现热耐受有关，从而会导致抗癌效果差[15-17]。热休克应答可使细胞产生HSP70，为热应激后产生的一系列保护性应激蛋白的一部分，对细胞的生存起重要作用[18]。EHD2是一种存在于膜内的内吞调控蛋白，它具有调节信号转导以及抑制恶性肿瘤的功能，据资料表明EHD2在结直肠癌中的表达会显著增强。结直肠癌的分化程度以及淋巴转移都会对EHD2的表达产生一定的影响，在结直肠癌处于较低的分化程度时，EHD2这种蛋白的表达也较低[19-20]。本实验还发现P-gP、Survivin、HSP70、EHD2这四种通道蛋白都与结直肠癌的分化程度以及淋巴转移具有一定的关系，四者存在协同的作用，至于其中具体的机制需要进一步实验分析。

综上，本研究发现P-gP、Survivin、HSP70、EHD2这四种通道蛋白与结直肠癌的发生、转变以及发展等具有较为密切的关系，对P-gP、Survivin、HSP70、EHD2这四种通道蛋白的检测有利于对疾病的诊断以及病情的评估，故结直肠锯齿状息肉病相关通道蛋白表达水平对患者病情评估价值可在临床实践中应用。