蔡碧莲，文亦磊，罗伟生

1.广西中医药大学(南宁 530001)；2.广西中医药大学第一临床医学院(南宁530023)

肝纤维化是由多种因素引起的肝细胞损伤或坏死，致使肝脏内纤维结缔组织发生异常增生，肝细胞内外基质异常沉积。据文献记载[1]，引起肝纤维化的因素包括：肝细胞发生炎症反应、药物毒性损害、肝脏感染、肝脏血流异常、先天性异常和代谢障碍、胆汁流动受阻等，这些因素均可导致胶原纤维合成、沉积、降解、吸收之间的动态平衡遭到破坏，导致肝纤维化的发生、发展。肝纤维化是各种肝病发展成肝硬化的必然经过的病程过程。

建立高效、稳定的动物肝纤维化模型是进一步开展临床药物研究的重要前提。本实验拟采用经典皮下注射四氯化碳溶液和皮下注射四氯化碳溶液复合灌胃无水乙醇两种复制模型进行比较研究，探讨两种方法优劣及造模前期和过程中的注意事项，为肝纤维化动物实验选择最佳造模方法提供依据，现总结如下。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：SD大鼠30只，雄性，清洁级。体质量80～100 g，由湖南医科大学购进，实验动物许可证号：SCXK(湘)2014-0011，垫料、饲料均由苏州新区枫桥净化设备有限公司提供，实验场所由广西中医药大学第一附属医院实验动物中心提供。饲养条件：温度23～25℃，空气湿度50%～60%。用标准大鼠箱饲养，每箱5只，适应性喂养1周后开始造模。

1.2 主要试剂：四氯化碳[CCl4，批号：(津)XK-13-011-00034]；橄榄油；4%组织细胞固定液(批号：20190403)；水合氯醛(批号：181120)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(批号：2001-0367)；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(批号：2001-0367)；无水乙醇；75%医用酒精；生理盐水。

2 研究方法

2.1 肝纤维化模型建立：将30只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为三组：正常对照组10只、四氯化碳溶液复合乙醇组、10只四氯化碳溶液组10只。正常对照组：常规喂养。四氯化碳溶液复合乙醇组：用40%四氯化碳悬溶液(体积比为四氯化碳溶液∶橄榄油=2∶3)四肢皮下注射，剂量为0.3 ml/kg，2次/周，并从实验第2周开始经口灌胃无水乙醇，剂量为1 ml/kg，隔天1次造模。四氯化碳溶液组：用40%四氯化碳悬溶液(体积比为四氯化碳溶液∶橄榄油=2∶3)四肢皮下注射，剂量为0.3 ml/kg，2次/周。大鼠每周称体质量1次，并按体质量增长而相应调整造模药物的剂量。

2.2 血生化检查：造模第10周结束后，禁食24 h，腹腔注射剂量为0.3 ml/kg水合氯醛进行麻醉，麻醉成功后立即打开腹腔，腹主动脉采血，按照试剂盒说明书检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬门氨酸氨基转氨酶(AST)含量。

2.3 组织染色及病理分级：肝组织标本以4%组织细胞固定液固定、石蜡包埋，制作5 μm组织切片，进行HE及Masson染色。显微镜下进行观察，肝纤维化病理分级标准参考[2]：S0级：无纤维化；S1级：部分门管区有纤维增生，有或无短的纤维隔膜；S2级：大多数门管区有纤维增生，有或无短的纤维隔膜；S3级：大多数门管区有纤维增生，偶见门管区以纤维桥连；S4级：门管区纤维桥连，同时伴有明显的纤维桥连(门管与门管之间及门管与中心静脉之间)；S5级：明显的桥连[门管与门管和(或)门管与中心静脉之间]，偶见结节(不完全硬化)；S6级：可能或明确的肝硬化。

结 果

1 大鼠一般情况 造模期间，正常对照组均表现活泼，毛发光泽，进食正常，大小便正常，体质量增长速度较快；四氯化碳溶液复合乙醇组大鼠活动度尚可，精神一般，反应稍减弱，肌肉松弛，毛发较稀疏，食欲尚可，便少，体质量缓慢增加；四氯化碳溶液组大鼠行为激进，精神烦躁，毛发枯黄，食欲尚可，便少，体质量缓慢增加。

2 不同造模方式的成功率和死亡率 各组造模大鼠均为10只，其中正常对照组、四氯化碳溶液复合乙醇组、四氯化碳溶液组造模大鼠非正常死亡分别为0只、2只及3只，死亡率分别为0%、20%、30%；各组造模周期结束后处死各组大鼠，HE及Masson染色发现正常对照组、四氯化碳溶液复合乙醇组、四氯化碳溶液组分别有0只、5只、3只大鼠肝组织达到了S5级以上(含S5级)，成功率分别为0%、50%及30%；其中推测大鼠死亡原因是注射部位经久不愈、溃烂、感染而亡，或大鼠之间撕咬致死。见表1。

表1 各组大鼠用药后死亡及肝纤维化情况(只)

3 肝功能检测结果 各组造模周期结束后，四氯化碳溶液复合乙醇组、四氯化碳溶液组大鼠血清ALT、AST的含量较正常对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；四氯化碳溶液复合乙醇组大鼠血清ALT、AST的含量与四氯化碳溶液组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但其含量较四氯化碳溶液组有明显升高。见表2。

注：与正常对照组比较，*P<0.05

4 肉眼及镜下对大鼠肝纤维化病变观察 各组造模周期结束后，打开大鼠腹腔，肉眼观察发现正常对照组大鼠无腹水，无肠系膜上血管增粗，肝脏表面光滑，质地柔软，边缘钝化。镜下HE及Masson染色可见肝细胞索排列整齐，无炎细胞浸润，无脂肪变性，肝小叶结构无明显异常，肝血窦以中心静脉为中心呈放射状分布(图1、2)；肉眼观察发现四氯化碳溶液复合乙醇组(ISHAK评分达S5级)大鼠出现腹水，肠系膜上血管增粗，肝脏外观偏暗红色，质地较硬，肝脏表面凹凸不平，小结节样改变，HE染色见正常肝细胞索排列紊乱，正常肝小叶结构破坏并有明显的桥连，门管与门管及门管与中心静脉之间可见有假小叶形成，甚至肝硬化形成。Masson染色可见汇管区胶原纤维明显增生，包绕正常肝组织，假小叶形成(图3、4)；肉眼观察四氯化碳溶液组发现大鼠腹水不多，肠系膜上血管稍增粗，肝脏表面较光滑，质地较柔软，镜下HE及Masson染色可见肝细胞索排列紊乱，伴少量炎细胞浸润，正常肝小叶结构被破坏并有纤维间隔形成，部分可见有假小叶形成(图5、6)。

讨 论

据统计，在我国肝纤维化常以乙型或丙型病毒性肝炎迁延不愈所致[3]，其中约有20%～30%慢性肝炎患者最终会发展为严重的肝纤维化或肝硬化病变。研究发现，星状细胞(HSC)是肝纤维化形成的关键。HSC活化后不仅细胞大量增殖，而且还表现为细胞个体分泌纤维能力增强，大量生成细胞外基质(ECM)，并可自分泌TGF β1等细胞因子，维持自身活化状态[4]。因此建立高效的肝纤维化动物模型对临床研究有着重要意义。现在诱导肝纤维的动物模型很多，因方法不同，所产生的机制不同，病理生理改变也不同。是否能成功地构建大鼠肝纤维化模型对于研究肝纤维化的发病机制、发病经过及如何治疗肝纤维化的重要前提条件。实验者通过以下方法构建大鼠肝纤维化模型，如：运用刀豆素A[5]，进行胆管结扎术[6-7]，注射猪血清或人血白蛋白[8-9]，利用血吸虫感染[10-11]，采用酒精[12]、四氯化碳灌胃[13]。这些实验方式分别会引起免疫性肝损害、胆汁淤积、自身免疫性肝纤维化、感染、中毒性肝损害，从而形成肝纤维化模型。免疫诱导性肝纤维化模型持续时间明显长于肝毒性(如CCl4所制模型)诱导所致的肝纤维化模型。由于人类的慢性乙、丙型肝炎所致的肝纤维化多为免疫性损伤。因此，此种方法所造模型更接近于慢性病毒性肝炎所致的肝纤维化[14]。CCl4所构建的肝纤维化动物模型是这些方法中造价成本相对低廉且实施方法相对简易，并且是最经典、最早、运用最广泛、也最受欢迎的方法之一。

本文所探讨的两种不同造模方法，在诱导肝纤维化过程中，产生机制如下：①据有关文献报道[15]，四氯化碳作为一种选择性肝毒性药物，在肝细胞内质网中，经肝微粒体内氧化酶的激活而产生自由基·CCl3，与肝细胞内大分子发生共价结合，产生活性氧自由基和脂质过氧化，致使正常肝细胞受到破坏，狄氏间隙内的储脂细胞释放Ⅳ型胶原酶，该酶可降解Ⅳ型胶原，促进肝纤维化形成。②乙醇在肝脏通过乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶系统进行氧化代谢产生毒性代谢产物乙醛。通过多种途径如肝细胞损害、诱导免疫反应、抑制三羧酸循环等损害肝脏结构和破坏肝脏功能，刺激胶原蛋白形成。胶原蛋白的合成是促进肝纤维化的发生原因之一[16]。在乙醇致肝细胞损伤作用下用四氯化碳能加速肝细胞坏死，缩短造模时间[17]。从血清生化指标分析：ALT升高，提示肝细胞损伤、细胞膜通透性增强。AST增高则反映肝细胞线粒体损伤。造模结束后，虽然四氯化碳溶液复合乙醇组大鼠血清ALT和AST的含量与四氯化碳溶液组大鼠血清ALT和AST的含量比较差异无统计学意义，但前者较后者有明显的升高。从死亡率和成模率分析：四氯化碳溶液复合乙醇组大鼠死亡率较四氯化碳溶液组低，肝纤维化分期达5级以上(含S5级)的成模率，四氯化碳溶液复合乙醇组大鼠较四氯化碳溶液组高。由此可推断：四氯化碳溶液复合乙醇组构建肝纤维化模型具有以下优点：①肝纤维化程度较理想；②构建肝纤维化周期短；③操作相对简便；④大鼠死亡率低。

在构建肝纤维化模型中，笔者体会：①掌握熟练的操作技巧，避免将四氯化碳溶液注射至血管内；②开始实验的大鼠体重应控制在100 g左右，方便抓持大鼠，减少大鼠挣扎；③后期大鼠体重可达300～400 g，可用易拉罐，将大鼠套入其中，减少大鼠挣扎、伤人；④选用大鼠四肢皮下注射，轮替注射，可减少注射部位感染；⑤造模过程严格把控大鼠饲料投喂量，若投喂量过多后期大鼠肥硕，脂肪肝程度加重，不利于进一步研究。