周娟娟， 杨俊梅， 高凯杰， 杨俊文

近年来，多重耐药细菌的检出率在儿科临床中日益增多[1-2]，给抗感染治疗带来严峻挑战，这使得监测临床分离菌的分布和耐药性变迁显得尤为重要。为儿科临床合理使用抗菌药物及医院感染控制工作提供理论依据，现将河南省儿童医院2018年分离细菌的分布和耐药性监测结果报道如 下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 收集2018年河南省儿童医院所有临床分离的菌株，共计8 825株，对同一患者分离的重复菌株只采用首次分离菌。

1.1.2 仪器与试剂 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）及配套的试剂盒靶板购自德国Bruker 公司和美国Sigma公司； Phoenix 100 全自动微生物鉴定药敏仪及其配套药敏卡（阴性杆菌药敏卡型号为：NMIC/ID-4，阳性球菌药敏卡型号：PMIC/ID-55，链球菌药敏卡型号：SMIC/ ID-2）、全自动血培养仪均购于美国 BD公司。哥伦比亚琼脂、伊红亚甲蓝琼脂、麦康凯琼脂、Mueller-Hinton琼脂、5%脱纤维羊血MH琼脂、流感嗜血杆菌属培养基（HTM）加SR0158营养补充剂等实验中所用到的培养基和药敏纸片均为英国OXOID公司商品；药敏测试盒为美国BD公司产品；青霉素、万古霉素和美罗培南E试验条为郑州安图公司商品。

1.2 方法

1.2.1 菌种鉴定和药敏试验 采用MALDI-TOF MS鉴定菌种，Phoenix 100 全自动微生物鉴定药敏仪和纸片扩散法相结合进行药敏试验，按《全国临床检验操作规程》第3版规定和各仪器相关操作说明书进行相关操作。革兰阴性菌（除嗜血杆菌属外）、葡萄球菌属和肠球菌属采用Phoenix 100 全自动微生物鉴定药敏仪；嗜血杆菌属等苛养菌采用纸片扩散法；链球菌属除青霉素和美罗培南采用E试验法外，其余抗菌药物采用自动化仪器（BD Phoenix 100系统）。金黄色葡菌球菌ATCC 25923（纸片法）和ATCC 29213、粪肠球菌ATCC 29212、肺炎链球菌 ATCC 49619 、大肠埃希菌 ATCC 25922、铜绿假单胞菌 ATCC 27853、肺炎克雷伯菌 ATCC 700603和流感嗜血杆菌 ATCC 49247为质控菌株。质谱仪的质控品为IVD BTS溶液。按2018年CLSI推荐的药敏试验方法及折点标准进行药敏试验，判读药敏结果[3]。凝固酶阴性葡萄球菌和草绿色链球菌只收集血液、脑脊液和其他无菌体液标本的菌株。

1.2.2 β内酰胺酶检测 使用头孢硝噻吩试验检测流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌中β内酰胺酶。超广谱β内酰胺酶（ESBL）的检测使用 CLSI 推荐的微量肉汤稀释法和酶抑制剂增强试验进行筛选和确证大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌中产ESBL的菌株。

1.2.3 不敏感革兰阳性菌的检测 对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺不敏感的革兰阳性菌，采用相应的E试验条测定最低抑菌浓度（MIC）值。

1.2.4 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）的定义[4]对亚胺培南、美罗培南或厄他培南中任一碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌。

1.2.5 数据分析 使用 WHONET 5.6 软件和2018年CLSI的折点标准进行统计分析。

2 结果

2.1 细菌及其分布

2018年我院共分离到病原菌8 825株，其中革兰阴性菌5 958株，占67.5%，革兰阳性菌2 867株，占32.5%；排在前五位的为嗜血杆菌属、肺炎链球菌、大肠埃希菌、克雷伯菌属和金黄色葡萄球菌。革兰阴性菌中，占前三位的为嗜血杆菌属、大肠埃希菌、克雷伯菌属；革兰阳性菌中，占前三位的为肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌。见表1。8 825株细菌在各类标本中的分布为呼吸道分泌物70.2%，眼分泌物9.3%，血液、骨髓4.8%，脓液4.7%，粪便2.0%，尿液1.9%，脑脊液、腹水、胸水和关节液等无菌体液2.9%，其他标本4.2%。呼吸道标本中检出率前三位的细菌为嗜血杆菌属32.0%，肺炎链球菌15.0%，克雷伯菌属8.2%；眼分泌物标本中检出前三位的细菌为嗜血杆菌属27.0%，肺炎链球菌26.0%，金黄色葡萄球菌12.0%；血液、骨髓标本前三位为凝固酶阴性葡萄球菌50.0%，克雷伯菌属8.3%，大肠埃希菌7.0%；脑脊液、腹水、胸水和关节液等无菌体液标本中大肠埃希菌27.0%，肠球菌属14.0%，克雷伯菌属7.4%。

表1 8 825 株细菌的分布Table 1 Distribution of 8 825 bacterial strains by species

2.2 常见革兰阳性菌对抗菌药物的敏感性

2.2.1 链球菌属 2018年共分离肺炎链球菌1 448株，其中脑膜炎株占0.8%（11株），非脑膜炎株占99.2%（1 437株）。在肺炎链球菌中，4株脑膜炎株和2株非脑膜炎株对青霉素不敏感；1 437株非脑膜炎株对头孢噻肟和美罗培南的耐药率低（＜10%）；对红霉素、克林霉素、四环素和甲氧苄啶-磺胺甲唑的敏感率较低。分离自血液或脑脊液等无菌体液标本中的草绿色链球菌共53株，其中约50%菌株对青霉素不敏感。分离的30株β溶血链球菌中24株为化脓链球菌，6株无乳链球菌，均对青霉素敏感。未发现对万古霉素和利奈唑胺不敏感的链球菌属。见表 2。

2.2.2 葡萄球菌属 金黄色葡萄球菌680株，其中MRSA占36.6%（249株）；凝固酶阴性葡萄球菌285株，其中MRCNS占77.5%（221株）。MRSA对红霉素、克林霉素和四环素的耐药率要高于MSSA；而对庆大霉素和甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率略低于MSSA。对于分离自无菌体液标本的凝固酶阴性葡萄球菌，MRCNS对所测试的抗菌药物的耐药率均高于MSCNS。未发现对万古霉素和利奈唑胺不敏感的葡萄球菌。见表3。

2.2.3 肠球菌属 142株肠球菌属中屎肠球菌占64.8%（92株），粪肠球菌占23.9%（34株），其他肠球菌占11.3%（16株）。屎肠球菌对大部分抗菌药物的耐药率要高于粪肠球菌，对四环素的耐药率要低于粪肠球菌（68.5%对82.4%）。未检出对利奈唑胺和万古霉素不敏感的肠球菌。见表 4。

2.3 常见革兰阴性菌对抗菌药物的敏感性

2.3.1 嗜血杆菌属 2 119株流感嗜血杆菌中β内酰胺酶阳性率为58.0%（1 229株）； 380株副流感嗜血杆菌中β内酰胺酶阳性率为60.3%（229株）。流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌对甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率较高，均＞80%，对头孢他啶、头孢噻肟的耐药率较低，均＜2%，对氯霉素的耐药率均＜10%。副流感嗜血杆菌对阿奇霉素的不敏感率（42.3%）略高于流感嗜血杆菌的不敏感率（36.4%）。未发现对美罗培南不敏感的嗜血杆菌。见表5。

2.3.2 肠杆菌科 787株大肠埃希菌中产ESBL菌株占66.6%（524株）。642株肺炎克雷伯菌中产ESBL的菌株占72.0%（462株）。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBL菌株对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类的耐药率均明显高于非产ESBL株，见表6。肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对美罗培南、亚胺培南的耐药率为43.1%、43.2%和4.5%、4.2%；肠杆菌属细菌对美罗培南、亚胺培南耐药率为8.0%、4.0%；沙门菌属对美罗培南、亚胺培南耐药率均为0.8%。肺炎克雷伯菌对阿莫西林-克拉维酸和氨苄西林-舒巴坦的耐药率均＞50%；肺炎克雷伯菌对氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟的耐药率要高于大肠埃希菌、肠杆菌属和沙门菌属；大肠埃希菌对阿莫西林-克拉维酸和哌拉西林-他唑巴坦耐药率分别为19.2%和11.8%。见表7。

2.3.3 不发酵糖革兰阴性杆菌 145株铜绿假单胞菌对美罗培南、亚胺培南耐药率分别为21.2%、19.6%，对其他抗菌药物耐药率低。309株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率均为54.0%，对其他抗菌药物的耐药率高，均＞50%。见表8。

表 2 链球菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 2 Susceptibility of Streptococcus species to antimicrobial agents（%）

表3 葡萄球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility of Staphylococcus strains to antimicrobial agents（%）

3 讨论

本次监测显示，我院革兰阴性菌的检出率（67.5%）要高于革兰阳性菌（32.5%）。嗜血杆菌属、肺炎链球菌、大肠埃希菌、克雷伯菌属和金黄色葡萄球菌为本院的优势分离菌株，与2009－2015年北京儿童医院儿科临床分离情况不太一致，北京儿童医院的优势分离菌株为肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、克雷伯菌属和假单胞菌属[2]。这表明同类型医院不同地区之间病原菌的组成存在差异[5]，各地区的耐药情况需独立监测，医院感染控制和经验性抗感染策略也需根据本地区的数据作出相应的调整。

不同标本分离的优势菌株不一样，了解不同标本的常见致病菌，可以为儿科临床经验性用药提供依据。分离株主要来源于呼吸道标本，其次是眼分泌物标本和血、脑脊液等无菌体液标本，表明呼吸系统感染在儿童细菌感染性疾病中占重要比例，流感嗜血杆菌和肺炎链球菌为儿童呼吸道感染的主要致病菌[2，6]。在儿童眼分泌物标本中细菌检出率较高，流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌为优势病原菌，在其他的有关新生儿泪囊炎病原学的研究中肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌为主要致病菌[7-8]，而流感嗜血杆菌的检出率较低，因此儿童眼部感染（特别是新生儿泪囊炎）需提高对流感嗜血杆菌的重视。血、骨髓等无菌体液标本检出病原菌的比例较低，需要加强无菌体液标本的细菌培养来检测儿童感染性疾病。达16.4%，尤其是在呼吸道标本中。非脑膜炎肺炎链球菌对青霉素不敏感株的检出率为0.1%， 低于国内其他地区儿童医院的检出率[1-2，10]，但青霉素仍是临床治疗肺炎链球菌社区获得性肺炎的有效药物[11]。11株脑膜炎肺炎链球菌中有4株对青霉素耐药，在其他研究中也出现了高耐药肺炎链球菌[11]，因此要警惕肺炎链球菌侵袭性感染。肺炎链球菌对头孢噻肟和美罗培南较敏感，耐药率分别为0.4%和0.3%；对红霉素、克林霉素、四环素和甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率分别为99.6%、99.5%、74.8%和81.1%，与其他地区报道的耐药率大致接近[12]。本研究MRSA的检出率为36.6%，与国内报道儿童中的检出率大致相仿[1]，且北京地区监测到MRSA的检出率呈上升趋势[13]，需要引起重视。MRCNS的检出率为77.5%，略低于北京地区的数据[2]。未发现对万古霉素和利奈唑胺不敏感的葡萄球菌。屎肠球菌的检出率高于粪肠球菌，屎肠球菌的耐药率较高，而粪肠球菌的耐药率较 低。

表4 屎肠球菌和粪肠球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 4 Susceptibility of E. faecalis and E. faecium to antimicrobial agents（%）

表5 嗜血杆菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 5 Susceptibility of H. influenzae and H. parainfluenzae to antimicrobial agents （%）

表6 产与非产ESBL 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 6 Susceptibility of ESBLs-producers and non-ESBLs-producers to antimicrobial agents（%）

表7 肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 7 Susceptibility of Enterobacteriaceae species to antimicrobial agents （%）

表 8 不发酵糖革兰阴性菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 8 Susceptibility of non-fermentative gram-negative bacilli to antimicrobial agents （%）

革兰阴性菌特别是耐药菌感染日趋严重，对人类的生命健康造成巨大威胁[14-15]。流感嗜血杆菌的检出率居首位，表明其在儿科临床感染的地位非常重要。对于此类苛氧菌的检出需要特别的培养条件：巧克力培养基（嗜血型）和5% CO2。

肺炎链球菌是儿童脑膜炎和细菌性肺炎最常见的病原菌[9]，本次监测中肺炎链球菌的占比高流感嗜血杆菌β内酰胺酶阳性率为58.0%，与2017年全国儿童流感嗜血杆菌β内酰胺酶阳性率的水平接近[16]， 其对甲氧苄啶-磺胺甲唑和氨苄西林的耐药率较高，儿科临床在治疗流感嗜血杆菌感染时应减少这两种药物的使用。有研究表明副流感嗜血杆菌为婴幼儿呼吸道感染的主要病原菌[17]，本次监测副流感嗜血杆菌β内酰胺酶阳性率为60.3%。流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌对阿莫西林-克拉维酸耐药率为20.7%和21.8%，对氨苄西林-舒巴坦耐药率为35.4%和41.8%，对阿奇霉素的不敏感率为36.4%和42.3%，这三种药物仍可作为经验用药，但应加强监测。大肠埃希菌产ESBL菌株占66.6%，肺炎克雷伯菌产ESBL菌株占72.0%，跟国内儿科的相关研究大体一致[10]，但高于成人[14]。产ESBL菌株对受试药物的耐药率要高于非产ESBL的菌株。碳青霉烯类是治疗产ESBL菌株感染的首选药物[18]， 细菌对该类药物的耐药率已呈上升趋势[19]，本次监测中肺炎克雷伯菌对美罗培南、亚胺培南的耐药率为43.1%、43.2%，大肠埃希菌对美罗培南、亚胺培南的耐药率为4.5%、4.2%。在肠杆菌属和沙门菌属中也监测到对美罗培南、亚胺培南耐药的菌株，表明碳青霉烯类耐药菌株在革兰阴性杆菌中有播散流行的趋势，应加强对此类抗菌药物的合理使用。铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌是医院感染最常见的致病菌[2]，常引起患者的继发性感染。鲍曼不动杆菌中碳青霉烯类耐药株的检出率高于铜绿假单胞菌；铜绿假单胞菌对其他抗菌药物的耐药率较低，临床治疗此类感染时可供选择的抗菌药物较多。

本研究显示呼吸道分离菌株所占的比例较大，并且革兰阴性菌的检出率相对较高，应重视革兰阴性菌的儿童呼吸道感染。同时多重耐药菌的形势严峻，儿童脑脊液中青霉素不敏感肺炎链球菌的检出率高；金黄色葡萄球菌中MRSA的检出率高于成人；流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌产酶率高；碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的检出率高于成人；在肠杆菌属和沙门菌属中也监测到对碳青霉烯类耐药的菌株。对耐药菌株应加强监测和做好防控隔离措施，同时也要规范抗菌药物的合理应 用。