朱均昊， 赵 颖， 李 莉， 章强强

隐球菌脑膜炎是常见的真菌颅内感染，可发生于艾滋病和其他免疫功能低下人群，也可发生在免疫功能正常者[1]。过去认为隐球菌脑膜炎是艾滋病患者主要的机会性感染和常见的死亡原因，近年研究显示中国高达50%～77%隐球菌脑膜炎患者为免疫功能正常者[2-3]。该病诊断困难，需依靠实验室检查，常规的脑脊液墨汁染色涂片和真菌培养阳性率低和耗时较长。胶体金免疫层析法（lateral flow immunoassay， LFA）近年被开发用于隐球菌检测，与酶免疫测定和乳胶凝集试验相比，对隐球菌荚膜多糖抗原有着更好的灵敏度和特异度，可用于隐球菌脑膜炎的快速诊断[4-5]。然而绝大多数的临床研究都集中于艾滋病患者，对LFA在HIV阴性个体中的表现知之甚少。本实验旨在评估该法在诊断中国HIV阴性成人隐球菌病的灵敏度和监控功能。

1 材料与方法

1.1 材料

所有3 627例患者都来自于复旦大学附属华山医院2013年1月－2018年8月的住院患者，均排除HIV感染。其中，男2 168例，女1 459例；年龄16～86岁，平均45.8岁。隐球菌性脑膜炎的诊断[2]，以患者脑脊液隐球菌墨汁涂片和/或培养阳性，或组织病理见隐球菌为确诊；具备脑膜炎症状体征，脑脊液常规与生化检查异常，脑脊液涂片和培养阴性，但隐球菌荚膜多糖抗原阳性为临床诊 断。

为能合理评估实验室检查对隐球菌脑膜炎的诊断价值，避免抗真菌治疗对检查结果的影响，本研究剔除已抗真菌治疗1个月以上的患者，收集首次诊断隐球菌脑膜炎患者病历资料：初次的脑脊液常规和生化结果、墨汁涂片和培养结果，血和脑脊液的隐球菌荚膜多糖抗原滴度结果及HIV血清学结果。

1.2 方法

1.2.1 隐球菌LFA 采用隐球菌LFA检测试剂条（美国Immuno-Mycologics公司生产）检测患者的脑脊液标本。对隐球菌荚膜多糖抗原定性检测阳性的标本进行半定量检测滴度，若隐球菌抗原样本稀释1∶2 560出现强阳性结果，记录隐球菌抗原滴度＞1∶2 560；若仅定性试验阳性，稀释后为阴性，隐球菌抗原滴度则为1∶2。

1.2.2 脑脊液的真菌培养 培养基采用沙氏葡萄糖琼脂斜面，无菌条件下接种2管，分别置于25 ℃及37 ℃培养1周。

1.2.3 隐球菌墨汁染色镜检 将2 mL以上的脑脊液标本离心后，取沉淀与墨汁混匀镜检，在黑色背景下可见新型隐球菌周围有一圈透亮的荚膜。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据处理和统计分析，针对隐球菌脑膜炎患者治疗前后由LFA检测获得的隐球菌荚膜抗原滴度取常用对数后采用配对t检验进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隐球菌LFA的灵敏度和特异度

在检测的3 627例患者中，脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原阳性368例，其中确诊或临床诊断为隐球菌脑膜炎343例，24例为肺隐球菌病患者在排除中枢神经系统感染时发现脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原阳性，而墨汁涂片和培养阴性，诊断为隐球菌肺炎伴中枢神经系统感染可能，1例假阳性为自身免疫性脑炎患者。LFA的灵敏度为100%（367/367），特异度为99.97%（3 259/3 260）。

2.2 入院初次实验室检查结果

最终入选214例患者，初次诊断均为隐球菌脑膜炎，其中188例确诊为隐球菌脑膜炎，26例为临床诊断，见表1。

表1 隐球菌脑膜炎患者基本情况及实验室资料Table 1 Demographic characteristics and laboratory data of patients with cryptococcal meningitis

表1（续）Table 1（continued）

患者的脑脊液总体呈现葡萄糖和氯化物水平显著下降，蛋白含量增高，白细胞增多且以单核细胞为主的情况，49例患者的脑脊液葡萄糖未下降，经调查这部分的患者血糖值在（9.3±4.2） mmol/L，其中19例为明确的糖尿病患者。214例脑脊液隐球菌LFA检测均都检出隐球菌荚膜多糖抗原。脑脊液镜检和培养两种方法的灵敏度分别为75.23%（161/214）和78.04%（167/214），结果见表2。

表2 胶体金法检测阳性的214 例患者脑脊液培养和墨汁染色的结果Table 2 CSF culture and CSF ink staining for detection of Cryptococcus in the 214 patients positive in lateral flow immunoassay

2.3 脑脊液动态监测治疗情况

通过分析病例资料，脑脊液墨汁涂片、培养及隐球菌荚膜多糖抗原对于病情的监测情况各不相同。在治疗后，患者脑脊液培养保持阳性的中位时间是5.5 d（3～117 d），墨汁涂片保持阳性的中位时间是70.5 d（3～580 d），脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原保持阳性的中位时间是214 d（5～1 725 d），血隐球菌荚膜多糖抗原保持阳性的中位时间是300.5 d（36～1 843 d）。大多荚膜多糖抗原滴度随治疗时间的推移呈不规则的下降趋势，因部分患者死亡、转院等因素，对67例疗程较长且仍在本院治疗的患者治疗6个月前后的4项实验室检查进行比较，其中脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原滴度和血荚膜多糖抗原进行比较时均对滴度值取常用对数后进行配对t检验，见表3。

表3 67 例长疗程患者治疗6 个月实验室监测隐球菌脑膜炎疗效Table 3 Laboratory monitoring of treatment efficacy in 67 patients with cryptococcal meningitis

3 讨论

隐球菌脑膜炎具有临床表现不典型、易误诊、病死率高等特点，因此早期诊断和及时治疗对于患者的预后至关重要[1]。有研究表明，隐球菌脑膜炎的预后与发病到确诊的时间显著相关，因此需要更多的实验室数据帮助诊断隐球菌脑膜炎[2]。

隐球菌脑膜炎患者脑脊液常表现为非化脓性改变，脑脊液生化表现为蛋白含量升高、葡萄糖、氯化物水平降低。本组80%左右患者脑脊液中葡萄糖、氯化物、蛋白发生了相应的改变，然而这与早期结核性脑膜炎的脑脊液改变相似，临床诊断仍需要新型隐球菌感染的实验室证据。

脑脊液或脑组织病原学检查发现隐球菌是隐球菌脑膜炎诊断的金标准，脑脊液墨汁涂片是长期以来国内最常用的检测方法，操作简单，可快速、早期检测隐球菌，检出率在50%～90%[2-3，5]，对于HIV阴性的隐球菌脑膜炎患者，初次的墨汁涂片阳性率达到了75.23%，影响隐球菌检出的主要原因可能与脑脊液中的菌量较少有关。脑脊液培养阳性同样可以直接诊断隐球菌脑膜炎，但阳性培养时间长，需2～10 d，不利于快速诊断，本次是初次诊断的数据，脑脊液在沙氏培养基上阳性率达到了78.04%，与阳性率相关的因素是脑脊液的菌量负载和活力，此外患者一经抗真菌治疗后，脑脊液培养会很快转阴。一项系统性回顾表明，LFA检测脑脊液中的隐球菌荚膜多糖抗原的灵敏度和特异度分别可以达到98.9%（95%CI，97.9%～99.5%）和98.9%（95%CI，98.0%～99.5%）[6]，本研究中，此方法的灵敏度为100%，特异度为99.97%，优于墨汁涂片和培养法。LFA只需要10 min即可获得结果，避免了脑脊液培养耗时长的缺点，因其易观察性，对操作员的要求不高；也避免了在墨汁涂片中因对隐球菌形态认识不足造成的假阴性，与其他免疫方法相比，LFA试剂在室温下稳定，实验室设备和人员的要求都不高，适合推广。

隐球菌脑膜炎的治疗疗程较长，除了脑脊液常规、生化，脑脊液涂片和真菌培养在内的检测手段，在治疗后一般迅速转为阴性，很难为临床提供参考。本研究的统计中发现隐球菌脑膜炎在明确诊断开始治疗后，在培养中位时间5 d左右就转为阴性，墨汁染色的阳性在中位时间2个月左右消失。而临床在初始治疗后依然需要实验室的检测指标来密切观察患者的治疗情况，防止病情反复与复发。隐球菌LFA在疾病进展期抗原滴度会随之增高，而临床表现改善时则滴度下降的特性有助于了解患者病情变化和抗真菌药物的疗效[7]。本研究中，经有效治疗半年后，67例随访患者的脑脊液和血隐球菌抗原随着患者临床症状的改善，滴度也呈下降趋势，但抗原阳性有一定的滞后性。本研究中患者的脑脊液和血中的荚膜多糖抗原阳性最长可以维持近5年，可能是死亡的隐球菌持续释放荚膜多糖抗原，或者部分患者清除抗原缓慢所致[8-9]，这使单纯依赖抗原滴度来评估患者的治疗有一定的局限性，不能作为终止治疗的指标[10]。但血隐球菌荚膜多糖抗原检测因为创伤小、易于采集，在观察后续治疗时得到了更广泛的应 用。

对于肺部隐球菌病且免疫功能正常的患者，美国感染病学会2010年更新的指南指出，需要进行腰椎穿刺排除无症状的中枢神经系统感染，本结果也证实了部分隐球菌肺炎患者腰椎穿刺有脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原阳性，但滴度较低，范围在1∶2～1∶20，均值在1∶10，脑脊液培养及镜检皆为阴性，但如果这部分患者有头痛等症状，脑脊液生化有改变，仍需治疗且同时进行隐球菌荚膜多糖抗原检测的随访。

综上所述，隐球菌脑膜炎患者脑脊液常规、生化有一定的特征性，当其发生异常时，临床医师应考虑患者隐球菌感染的可能性，并进一步加强隐球菌的病原学检测。隐球菌LFA具有很高的灵敏度，与脑脊液的镜检和培养有高度的一致性，操作简便省时，不需要复杂的实验室设备，适用于隐球菌脑膜炎的快速筛查，提高疾病的早期诊断率，且用其作动态监测也有利于观察病 情。