张 慧， 沈 芳， 周 聪， 徐茂锁， 刘亚隽

随着临床抗菌药物的广泛应用，细菌耐药率不断上升，出现了多重耐药菌甚至广泛耐药（XDR）菌，这给临床的抗感染治疗带来了极大的挑战。动态监测临床分离菌的构成及耐药情况，可以给临床制定科学合理的抗菌药物使用方案提供依据。现将2016－2018年上海市第五人民医院细菌耐药性监测结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2016年1月－2018年12月我院患者的临床分离菌株，剔除同一患者相同部位的重复菌株，对于凝固酶阴性葡萄球菌和草绿色链球菌，只收集血液、脑脊液及其他无菌体液培养阳性的菌株，共计7 995株。

1.1.2 仪器和试剂 使用法国生物梅里埃公司的VITEK 2-Compact检测系统，配套药敏测试卡为革兰阴性菌药敏测试卡（GN13）、革兰阳性菌药敏测试卡（GP67）和肺炎链球菌药敏测试卡（GP68）。部分补充抗菌药物纸片扩散法的药敏试验和酶抑制剂增强确证试验所用抗菌药物纸片均来自北京天坛公司，药敏试验MH培养基和5%脱纤维羊血培养基为上海伊华公司产品，HTM培养基为上海科玛嘉公司产品。头孢硝噻吩纸片为英国OXOID公司产品。E试验条为郑州安图生物工程股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 参照CLSI推荐的药敏试验的规范[1]，采用自动化仪器进行，并按上海市耐药监测网技术方案的要求补充米诺环素、磷霉素、美罗培南、哌拉西林、头孢哌酮和头孢哌酮-舒巴坦等抗菌药物的纸片扩散法。草绿色链球菌、β溶血链球菌和流感嗜血杆菌药敏试验采用纸片扩散法进行。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 29213和ATCC 25923（纸片法），大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853，粪肠球菌ATCC 29212，肺炎链球菌ATCC 49619，流感嗜血杆菌ATCC 49247等。

1.2.2 β内酰胺酶检测 采用头孢硝噻吩纸片定性检测流感嗜血杆菌中产β内酰胺酶的菌株。按CLSI推荐的酶抑制剂增强确证试验检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌中产ESBL菌株。

1.2.3 克林霉素诱导耐药试验（D试验） 按照CLSI 2018年推荐的红霉素和克林霉素联合纸片法检测葡萄球菌属和β溶血链球菌中对红霉素耐药、对克林霉素中介或敏感的菌株。

1.2.4 青霉素不敏感肺炎链球菌（PNSP）检测 经苯唑西林纸片（1 μg/片）测定抑菌圈直径 ≤19 mm的肺炎链球菌则需要用青霉素E试验条测定其MIC，按照CLSI 2018 年非脑膜炎肺炎链球菌标准，分别判定为青霉素敏感、中介或耐药肺炎链球菌（PSSP、PISP、PRSP）。

1.2.5 耐万古霉素肠球菌（VRE）检测 对仪器法测定万古霉素为不敏感的菌株进行菌种复核，并用万古霉素E试验条测定确认MIC值。

1.2.6 特殊耐药菌株定义 XDR菌株为对除多黏菌素和替加环素之外的其他抗菌药物全耐药者[2]。碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）定义为对美罗培南、亚胺培南或厄他培南中任一抗菌药物耐药者[2]。

1.2.7 数据统计分析 采用WHONET 5.6和SPSS 22.0软件对实验结果进行统计分析。

2 结果

2.1 细菌分布

2016－2018年共收集临床非重复分离菌7 995株，其中革兰阴性杆菌5 737株（71.8%），革兰阳性球菌2 258株（28.2%）。7 995株中肠肝菌科细菌3 328株（41.6%），其中最多见者依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和奇异变形杆菌；不发酵糖革兰阴性杆菌2 119株，其中最多见者依次为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和伯克霍尔德菌属；革兰阳性菌中最多见者依次为肠球菌属、金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。主要临床分离菌分布见表 1。标本来源为呼吸道占47.2%、尿液26.3%、伤口脓液9.1%、血液6.6%、脑脊液等无菌体液5.5%、生殖道分泌物2.1%、粪便0.4%和其他标本（静脉导管、引流液和组织等）2.8%。

表1 主要临床分离菌分布Table 1 Distribution of the clinical isolates during the period from 2016 through 2018

2.2 革兰阳性球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率

2.2.1 葡萄球菌属 2016－2018年MRSA 的3年检出率分别为33.2%、39.6%和41.5%，儿童MRSA检出率高于成人（43.4% 对21.9%）；MRCNS 3年检出率分别为67.7%、74.0%和79.4%。MRSA和MRCNS对大环内酯类、氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物的耐药率高于甲氧西林敏感株（MSSA和MSCNS）。MRSA对庆大霉素、左氧氟沙星、红霉素和克林霉素的耐药率3年间有下降趋势（P＜0.05）；MRSA对甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率1.4%～5.6%，显著低于MRCNS的耐药率37.8%～54.0%（P＜0.01）。见表2、表3。3年间金黄色葡萄球菌D试验阳性检出率依次为81.1%（60/74）、86.2%（50/58）和83.7%（36/43）。未检出耐万古霉素和利奈唑胺的葡萄球菌。

2.2.2 肠球菌属 736株肠球菌中屎肠球菌占55.4%，粪肠球菌占39.5%，其他占5.0%。未发现利奈唑胺耐药的肠球菌；VRE的检出率为0.5%（4/736），均为屎肠球菌且经万古霉素E试验方法复核，3株MIC值为32 mg/L，1株为48 mg/L。屎肠球菌对氨苄西林、左氧氟沙星和呋喃妥因的耐药率显著高于粪肠球菌（P＜0.01）；屎肠球菌对四环素的耐药率低于粪肠球菌，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表4。

2.2.3 链球菌属 121株β溶血链球菌中80.2%（97/121）为无乳链球菌，该菌D试验阳性检出率为26.7%（4/15）。分离自血液或脑脊液等其他无菌体液的草绿色链球菌79株，未发现对青霉素耐药的菌株。分离自呼吸道的肺炎链球菌119株中PNSP占8.4%，PSSP为91.6%；PNSP对测试抗菌药物的耐药率高于PSSP。草绿色链球菌和无乳链球菌对红霉素和克林霉素的耐药率均近40%或以上，其余各组链球菌对该两药的耐药率可达80%以上。未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药的链球菌。见表5。

2.3 革兰阴性菌对抗菌药物的耐药率和敏感 率

2.3.1 肠杆菌科细菌 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌中产ESBL菌株分别占766株（54.4%）、363株（27.1%）和51株（44.7%）。大肠埃希菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率均为1.3%，对头孢曲松、环丙沙星、氨苄西林和甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率均高于50%；分离自尿液的大肠埃希菌对磷霉素的敏感率为93.0%。克雷伯菌属对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别从2016年的17.8%和18.0%上升至2018年的33.7%和34.0%。肠杆菌科细菌（克雷伯菌属除外）对碳青霉烯类、阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦和头孢哌酮-舒巴坦耐药率较低，均≤8.6%。见表6。

表2 金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 2 Susceptibility of MRSA and MSSA strains to antimicrobial agents by year（%）

表3 凝固酶阴性葡萄球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 3 Susceptibility of MRCNS and MSCNS strains to antimicrobial agents by year（%）

表4 屎肠球菌和粪肠球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 4 Susceptibility of E. faecium and E. faecalis to antimicrobial agents by year（%）

表4（续）Table 4（continued）（%）

表5 链球菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 5 Susceptibility of Streptococcus isolates to antimicrobial agents（%）

表6 肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 6 Susceptibility of Enterobacteriaceae species to antimicrobial agents（%）

表6（续）Table 6（continued）（%）

2.3.2 不发酵糖革兰阴性杆菌 3年间XDR铜绿假单胞菌（XDR-PA）和鲍曼不动杆菌（XDRAB）的检出率分别为2.3%（18/792）和15.9%（150/942）。792株铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为19.5%和19.6%，对多黏菌素B的耐药率为0.4%，对所测试的两种酶抑制剂复合制剂、庆大霉素、阿米卡星和头孢吡肟的耐药率＜10%。鲍曼不动杆菌对头孢哌酮-舒巴坦和米诺环素的耐药率较低（ 30.4%和19.5%），对其他大多数测试药物的耐药率接近或超过60%。嗜麦芽窄食单胞菌对测试抗菌药物的敏感率≥90.5%。洋葱伯克霍尔德菌对美罗培南、头孢他啶、左氧氟沙星、米诺环素和甲氧苄啶-磺胺甲唑的敏感率为85.7%～95.2%。见表7。

2.3.3 其他革兰阴性菌 133株流感嗜血杆菌均分离自呼吸道标本，其中儿童95株，成人38株。儿童和成人的流感嗜血杆菌中β内酰胺酶的检出率分别为48.4%和34.2%；儿童分离株对氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦和甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率高于成人，差异均有统计学意义（P＜0.05）。流感嗜血杆菌对头孢噻肟、美罗培南和左氧氟沙星敏感率≥92.0%；对阿奇霉素近30%为不敏感菌株。见表8。分离自呼吸道的卡他莫拉菌共133株，儿童和成人分别为98株和35株，β内酰胺酶检出率为98.5%（131/133）。

2.3.4 CRE 2016－2018年CRE的检出率依次为7.8%（92/1 180）、11.8%（125/1 060）和14.5%（157/1 083）。分离出CRE菌株的科室主要集中在急诊观察室（30.2%）、ICU（22.7%）、呼吸内科（11.0%）、神经外科（9.6%）和老年科（7.0%）等23个科室。CRE中以肺炎克雷伯菌为主，占90.9%（340/374），大肠埃希菌4.8%（18/374），弗劳地枸橼酸杆菌1.9%（7/374）。340株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、喹诺酮类、哌拉西林-他唑巴坦和头孢哌酮-舒巴坦的耐药率均超过90%，但对阿米卡星和甲氧苄啶-磺胺甲唑的耐药率相对较低，分别为57.6%和39.1%，对多黏菌素的耐药率为1.8%。

表8 流感嗜血杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table 8 Susceptibility of Haemophilus influenzae isolates to antimicrobial agents（%）

3 讨论

本组资料显示，2016－2018年本院临床分离菌中革兰阴性杆菌占比大于革兰阳性球菌，与2017 年 CHINET监测报道一致[3]；大肠埃希菌占分离菌首位，其次为克雷伯菌属、不动杆菌属、铜绿假单胞菌、肠球菌属、金黄色葡萄球菌等。临床分离菌中以呼吸道和尿液标本为主，其次为伤口脓液和血液等，与刘艳君等[4]报道一致。金黄色葡萄球菌占分离菌第6位， MRSA检出率由2016年的33.2%上升至2018年的41.5%，高于2017 年 CHINET 监测结果[3]；儿童MRSA检出率高于成人，应引起重视。MRCNS的检出率由67.7%升至79.4%，略低于2017 年CHINET监测结果[3]。MRSA对甲氧苄啶-磺胺甲唑的敏感率＞93%，与 MRSA不同的是MRCNS对甲氧苄啶-磺胺甲唑的敏感率＜58%，提示临床对治疗耐甲氧西林葡萄球菌感染要区别对待[5]。对耐甲氧西林葡萄球菌感染的重症患者，利奈唑胺和万古霉素仍然是首选。屎肠球菌对氨苄西林、左氧氟沙星、呋喃妥因的耐药率明显高于粪肠球菌，而对四环素的耐药率低于粪肠球菌，与其他相关报道一致[6]，提示临床怀疑肠球菌感染时要将细菌鉴定至种，并且尽早根据药敏试验结果选用抗菌药物。检出4株对万古霉素耐药的屎肠球菌，均分离自ICU的尿液标本，提示临床要加强流行病学调研，防止院内传 播。

本次监测资料显示克雷伯菌属占分离菌第2位，以肺炎克雷伯菌为主。2018年克雷伯菌属对亚胺培南和美罗培南的耐药率已达33.7%和34.0%，高于2005－2014年CHINET报道结果[7]。肺炎克雷伯菌可在呼吸道、肠道定植，因其高侵袭力可引起肝脏、血流、肺部、泌尿系统和腹腔等多部位感染，这提示临床应积极开展对高危患者的主动筛查，同时加强医务人员手卫生，彻底消毒病床及医疗器械，并对CRKP感染患者进行单间隔离、集中安置或分组护理[8]，降低耐药菌株院内传播的风险。CRE主要耐药机制是产碳青霉烯酶，以KPC和NDM1型金属酶多见[3]。CRE菌株的科室分布主要集中在急诊观察室、ICU、呼吸内科、神经外科和老年科；标本分布以呼吸道标本最多，其次为尿液标本；CRE中以肺炎克雷伯菌所占比例为最高。CRKP菌株对大部分常用抗菌药物高度耐药，因此实验室应开展如替加环素、头孢他啶-阿维巴坦等有效药物的药敏试验以供临床选择[9]。CRE多为XDR菌株，抗菌药物单药治疗的疗效往往并不满意，需联合用药[10]。

不发酵糖革兰阴性杆菌中以铜绿假单胞菌、 鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌为主。铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率为19.5%，监测结果显示，其耐药机制主要为非产酶机制，包括膜孔蛋白 OprD的丢失及细菌基因突变导致的多药泵出机制如MexA-MexB-OprM的高表达[11]。鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为63.4%和63.7%，对大多常用抗菌药物的耐药率也接近或高于60%，与张辉等[12]报道相似，而对头孢哌酮-舒巴坦的耐药率为30.4%，临床可以根据药敏试验结果作为联合用药治疗选择。XDR-AB菌株占其分离菌的15.9%，90.2%来源于ICU的呼吸道标本，这提示可能与患者长期住院，大剂量使用广谱抗菌药物和各种侵袭性操作频繁有关。

此次监测数据显示流感嗜血杆菌儿童和成人株氨苄西林耐药率为49.5%和34.2%。文献报道流感嗜血杆菌对氨苄西林的主要耐药机制是产β内酰胺酶水解β内酰胺类抗生素，常见的酶包括TEM-1型和 ROB-1型2种，绝大多数为TEM-1型[13]。流感嗜血杆菌儿童分离株对阿奇霉素不敏感率为31.9%，与王春等[14]报道一致，相关机制有待进一步研究。

综上所述，目前我院细菌耐药情况严峻，尤其是CRE和XDR-AB菌株，应继续做好细菌耐药性监测工作，为临床抗感染治疗及对病原体的耐药性评估提供科学依据，同时应加强院内感染防控，防止耐药菌的扩散和暴发流行。