杜芳玲， 魏丹丹， 梅艳芳， 龙 丹， 万腊根， 刘 洋

20世纪80年代中期，我国台湾学者首次报道了一种具有高黏液表型的肺炎克雷伯菌，被称为高黏液型肺炎克雷伯菌（HMKP），其常引起侵袭性感染，且易导致转移性感染[1]。随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用以及编码碳青霉烯酶的移动遗传元件的传播，耐碳青霉烯类（CR）-HMKP逐渐在全球范围内被发现[2-3]。CR-HMKP的出现对公众健康构成了严重威胁，因其可能在健康个体中引起严重的、无法治愈的感染[3]。本研究分析医院重症医学科（ICU）CR-HMKP血流感染患者的临床及分子特征，为临床预防及控制CR-HMKP感染提供依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及鉴定

2016年1月－2018年12月从南昌大学第一附属医院ICU血流感染患者中分离40株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CR-KP），采用VITEK 2-Compact全自动细菌鉴定仪进行生化鉴定并保存。血流感染患者纳入标准：血液标本培养分离出肺炎克雷伯菌，体温＞38 ℃或＜36 ℃，可伴有寒战，并合并下列情况之一，即①有入侵门户或迁徙病灶；②有全身中毒症状而无明显感染灶；③有皮疹或出血点、肝脾肿大、外周血中性粒细胞增多伴核左移，且无其他原因可以解释；④收缩压低于12 kPa（90 mmHg）或较原收缩压下降超过5.3 kPa（40 mmHg）[4]。

1.2 高黏液表型检测

用拉丝试验检测[5]，使用接种环从哥伦比亚血琼脂平皿上挑起过夜培养的受试肺炎克雷伯菌菌落，重复牵拉两次，若两次长度均大于5 mm即判为黏液丝试验阳性。

1.3 药敏试验和耐药基因检测

用VITEK 2-Compact全自动微生物分析仪进行体外药物敏感性试验（药敏卡GN13），参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）标准中对敏感、中介、耐药的解释。用改良碳青霉烯灭活试验（mCIM）方法初步筛查碳青霉烯酶[6]。热裂解法提取菌株DNA。参照文献 [7]，PCR扩增检测14种耐药基因，其中4种碳青霉烯酶基因（KPC、NDM、OXA-48、VIM）、2种16S rRNA甲基化酶基因（rmtB、armA）、3种β内 酰 胺 酶 基 因（blaCTX-M-14、blaSHV、blaTEM）和4种PMQR基因[qnrA、qnrB、qnrS、acc(6’)-Ib-cr]。

1.4 荚膜血清分型及毒力基因检测

参照文献 [8-9]，用PCR方法筛选高毒力荚膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57），扩增10种常见毒力基因（rmpA、iutA、rmpA2、magA、allS、wcaG、aerobactin、ybtS、entB、kfu）。

1.5 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

将菌液与低熔点胶混匀后灌模，蛋白酶K消化3 h，TE缓冲液和水清洗后，使用XbaⅠ内切酶（TaKaRa公司）消化4 h。配制1%的琼脂糖凝胶，在CHEF-DR Ⅲ（美国Bio-Rad公司）上进行PFGE，相似性＞80%的菌株被定义为相同的PFGE型[9]。

1.6 多位点序列分型（MLST）

P C R 扩增肺炎克雷伯菌的7 个管家基因（gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB）并进行测序，再与数据库比对（http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html），分析菌株的序列型[8]。

2 结果

2.1 临床特点

40例CR-KP血流感染患者以男性为主，年龄以≥60岁为主，侵袭性操作以气管插管占首位，均接受两种或两种以上侵袭性操作，均联合使用多种抗生素。CR-HMKP菌株感染患者60岁以上的占比、糖尿病患病率、死亡率比CR-非HMKP菌株感染患者高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 40 例CR-KP 血流感染患者临床特点Table 1 Clinical characteristics of 40 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains isolated from bloodstream infections in ICU patients

2.2 药敏结果

ICU血流感染患者分离的40株CR-KP均为多重耐药（MDR）菌，对临床使用的3类或3类以上抗菌药物同时呈现耐药，对碳青霉烯类和β内酰胺类药物耐药率达100%。CR-HMKP菌株对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星的耐药率比CR-非HMKP菌株低，且差异有统计学意义（P＜0.05）；除这3种抗菌药物外，其他抗菌药物对CR-HMKP菌株和CR-非HMKP菌株抗菌活性基本相同，差异无统计学意义。见表2。

表2 40 株CR-KP 菌株对抗菌药物的耐药率比较Table 2 Resistance profile of 40 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains isolated from bloodstream infections in ICU patients

2.3 耐药基因检测

40株CR-KP菌株mCIM结果阳性，14株CRHMKP菌株均携带KPC基因，26株CR-非HMKP中24株携带KPC基因，2株携带NDM基因。rmtB基因在CR-HMKP菌株的检出率小于CR-非HMKP菌株，且差异有统计学意义（P＜0.01），其他耐药基因在CR-HMKP菌株与CR-非HMKP菌株中分布一致，差异无统计学意义；未检出VIM、OXA- 48、armA、qnrA基因。见表3。

2.4 血清荚膜分型及毒力基因分布

CR-HMKP菌株中仅检出1株K2型菌株，其余CR-KP菌株的血清荚膜分型均未获分型。ICU血流感染CR-KP以ybtS基因和entB基因的流行最为广泛，阳性率分别为100%和82.5%。3种毒力基因rmpA、iutA、rmpA2在CR-HMKP菌株中的检出率均大于CR-非HMKP菌株，且差异有统计学意义（P＜0.01），其余7种毒力基因在CR-HMKP菌株与CR-非HMKP菌株中分布一致，差异无统计学意义。见表4。

表3 40 株CR-KP 的耐药基因分布Table 3 Prevalence of resistance genes among 40 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains

表4 40 株CR-KP 的毒力基因分布Table 4 Distribution of virulence genes among 40 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains

2.5 菌株同源性分析

PFGE和MLST分析显示CR-HMKP分为A和B型，A型（n=13，92.9%）均为ST11型，B型（n=1，7.1%）为ST65型。见图1。

图1 14 株CR-HMKP 的PFGE 和MLST 结果Figure 1 Pulsed field gel electrophoresis and multilocus sequence typing results for 14 strains of carbapenem-resistant hypermucoviscous K. pneumoniae isolated from bloodstream infections in ICU patients

3 讨论

CR-HMKP因其高毒力和获得性碳青霉烯类耐药性，已成为近年来最具挑战性的病原体之一。本研究中ICU血流感染患者中CR-HMKP在CR-KP中的检出率为35.0%，比Zhan等[3]报道的检出率（15%）高。血流感染中HMKP高检出率（45.9%）可能导致CR-HMKP的高检出率[10]。

临床资料显示大部分患者感染诊断前已联合使用抗生素治疗、入住ICU以及使用侵袭性操作，上述措施是CR-KP感染的重要危险因素[11]。CRHMKP菌株感染患者糖尿病患病率（42.9%）比CR-非HMKP菌株感染患者（7.7%）高，且差异有统计学意义（P＜0.05）。糖尿病被认为是高毒力肺炎克雷伯菌感染的重要危险因素[12]。ICU中CR-KP血流感染患者的死亡率高（70.0%），且CR-HMKP菌株感染患者死亡率（92.9%）比CR-非HMKP菌株感染患者（57.7%）高，差异有统计学差异（P＜0.05）。在ICU，因患者病情危重，免疫功能低下，并且还需要定期进行侵袭性的检查，容易发生血流感染，治疗困难且死亡率较高[13]。

药敏资料显示CR-KP菌株均为MDR菌，对大部分药物耐药率高。CR-HMKP菌株对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星的耐药率比CR-非HMKP菌株低，且差异有统计学意义（P＜0.05），表明临床上庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素对CR-HMKP感染患者可能是有价值的治疗选择。碳青霉烯酶（如KPC）的产生是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的最普遍机制[14]。本研究中所有CR-HMKP分离株均为KPC基因阳性，与之前发现的HMKP耐碳青霉烯类的原因相同[15]。

毒力基因检测显示rmpA、iutA、rmpA2基因在CR-HMKP菌株的检出率均大于CR-非HMKP菌株，且差异有统计学意义（P＜0.01）。rmpA和rmpA2基因参与菌株黏液性状的调控。iutA基因是编码产气毒素受体，该铁摄取途径可能与肺炎克雷伯菌的高毒力相关，受体增加是CR-HMKP菌株铁摄取能力提升的关键[16]。

Zhang等[17]报道在5株CR-HMKP分离株中，只有1株属于K2型，其余4株未分型，未分型中3株为ST11型。同样，本研究只发现1株CR-HMKP分离株属于K2型（1/14，7.1%），其余13株未分型，均为ST11型。相反，Yao等[18]报道7株耐碳青霉烯类CR-HMKP分离株中6株属于K2型。另外，Zhan等[3]发现了ST20型CR-HMKP。本研究中1株K2型菌株属于ST65型，这与先前的研究一致，ST65是K2血清型肺炎克雷伯菌中最常见的ST型[19]。

综上所述，本研究阐述了CR-HMKP菌株以ST11为主，均为MDR，携带多种耐药基因与毒力基因，且死亡率高。应加强对ICU的监测，重视血流感染的诊治与传播防控，提高医护人员对CRHMKP的认识，减少医院感染的发生。CR-HMKP与CR-非HMKP对氨基糖苷类抗生素的耐药情况有差别，临床在治疗过程中应区别对待。