廖文建， 祝兰兰， 杜芳玲， 龙 丹， 张 伟， 刘 洋

肺炎克雷伯菌是临床上仅次于大肠埃希菌最常见的机会致病菌，近年来世界各地报道均呈现高毒力、高耐药等特点，对医院感染的控制提出了严峻的挑战[1]。1980年国外学者提出细菌的获得性免疫系统CRISPR-Cas系统，主要由成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR ）及其相关序列（CRISPR associated sequences， Cas）组成[2]。在肺炎克雷伯菌中根据其Cas基因的构架主要分为I-E*型和I-E型CRISPR-Cas系统[3]。研究表明CRISPR-Cas系统参与干扰细菌毒力及获得性耐药，但具体机制不明确[4-5]。本研究探究高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）中CRISPR-Cas系统的分布及与毒力和耐药的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及鉴定

收集南昌大学第一附属医院2017年1月－2018年12月268株非重复肺炎克雷伯菌，采用VITEK 2-Compact全自动细菌鉴定仪进行生化鉴定并保存。鉴于目前鉴定hvKP的方法尚无统一标准，本研究定义hvKP为：①血清荚膜分型K1/K2菌株；②毒力基因rmpA/rmpA2阳性菌株[6]。

1.2 CRISPR-Cas系统检测

热裂解法提取粗制菌株DNA。参考Li等[4]、Lin等[7]文献，PCR扩增检测Cas1、Cas3、CRISPR1和CRISPR24个基因，PCR扩增的引物序列、退火温度参照相关操作进行。确定CRISPRCas系统的存在及类型（I-E*和I-E）。

1.3 药敏试验和耐药基因检测

体外药物敏感性试验用VITEK 2-Compact全自动微生物分析仪开展，参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）规定的标准对耐药（R）、敏感（S）的解释。PCR扩增检测14种耐药基因，其中5种碳青霉烯酶基因（blaKPC-2、blaOXA-48、blaVIM、blaIMP和blaNDM-1），3种β内酰胺酶基因（SHV、TEM和CTX-M-14），2种16S rRNA甲基化酶基因（amrA和rmtB），4种PMQR基因[qnrA、qnrB、qnrS和acc(6’)-Ib-cr]。PCR的扩增引物、条件和体系参照文献 [8]。

1.4 荚膜血清分型基因K1/K2和毒力基因检测

对所有肺炎克雷伯菌PCR筛选高毒力荚膜血清型基因K1/K2，并用PCR方法对其扩增14种常见毒力基因（magA、rmpA、terW、silS、iutA、rmpA2、kfuBC、wcaG、allS、kpn、entB、ytbS、repA、aerobactin）。PCR的扩增引物、条件和体系参照文献 [9-10]。

1.5 大蜡螟毒力实验

将所有培养在MH肉汤处于对数生长期的肺炎克雷伯菌通过离心悬浮法制成1.0×1011CFU/ L。设置标准菌株肺炎克雷伯菌ATCC 700603和NUTHK2044为毒力对照组，将配制的菌液用微量注射器经右后足注射10 μL入大蜡螟幼虫体腔，每株临床分离菌株菌液分别注入10条随机分配的幼虫。将所有大蜡螟置于一次性培养皿中37 ℃培养箱中孵育120 h，注射后记录24 h、48 h、72 h、96 h、120 h大蜡螟的存活情况，实验重复3次，最后统计每组大蜡螟平均半数生存时间（即每一次实验当10条大蜡螟存活剩余约5条的时候记录下观察时间，3次重复实验得到的半数生存时间取平均数）[11]。

1.6 细菌分子流行病学检测

采用多位点序列分型（MLST）对所有hvKP进行同源性分析。7个管家基因片段：rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB通过PCR扩增后直接测序，结果与网站（http：//www.Pasteur.fr/ recherch/ genopole/ PF8/ mlst/ primers_Kpneumoniae.html）已建立的标准程序进行比对[12]。

1.7 统计学分析

使用SPSS 20.0软件进行统计分析，根据携带CRISPR-Cas系统类型与否进行分组，对其荚膜血清分型、毒力基因、抗菌药物的耐药性、耐药基因进行比较。由于均为计量资料使用χ2检验进行分析，采用GraphPad Prism 5.0软件绘制Kaplan-Meier存活曲线，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床资料和菌株CRISPR-Cas系统分布

依据本研究hvKP诊断标准，从268株肺炎克雷伯菌筛选出61株hvKP，标本来源于61例患者，分离自血液34株、痰液14株、肝脓肿脓液9株、烧伤伤口分泌物1株、气道分泌物1株、中段尿液1 株、胸水1株。61株hvKP中携带CRISPR-Cas系统21株，阳性率为34.4%，均为I-E*型CRISPR-Cas系统，未检测到I-E型CRISPR-Cas系统；根据细菌CRISPR-Cas系统有无，所有hvKP分为CRISPR-Cas系统阳性组和CRISPR-Cas系统阴性组。通过比较两组细菌感染患者的临床资料显示，两组患者年龄、性别、基础疾病、ICU入住率、侵袭性操作及碳青霉烯类抗生素应用均未发现统计学差异，但两组间30 d病死率差异存在统计学意义（5/21对22/40，P=0.02）。此外药敏试验显示，CRISPRCas系统阴性组对12种抗菌药物耐药率明显高于CRISPR-Cas系统阳性组（P＜0.05），抗菌药物包括碳青霉烯类亚胺培南，β内酰胺类头孢他啶、头孢曲松、头孢唑林、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、氨曲南，喹诺酮类左氧氟沙星，氨基糖苷类妥布霉素、庆大霉素，甲氧苄啶-磺胺甲唑。所有hvKP对庆大霉素耐药率最低（21/61，34.4%）。见表1。

表1 患者临床资料、药敏结果与菌株CRISPR-Cas 系统分布Table 1 Clinical characteristics of patients and antibiotic susceptibility of hypervirulent K. pneumoniae isolates with or without CRISPR-Cas system

2.2 耐药基因分布与CRISPR-Cas系统分布的关系

61株hvKP中均未检测到VIM、IMP、OXA-48、qnrA，除blaNDM-1、qnrB差异无统计学意义外，CRISPR-Cas系统阳性组菌耐药基因blaKPC-2、blaSHV、blaTEM、blaCTX-M-14、rmtB、armA、qnrS、acc(6’)-Ib-cr阳性率均小于CRISPR-Cas系统阴性组菌，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。见表 2。

2.3 荚膜血清分型、毒力基因与CRISPR-Cas系统分布的关系

所有CRISPR-Cas系统阳性组血清荚膜分型均为K1型，未检测到K2型；CRISPR-Cas系统阴性组检测到K1型血清荚膜分型2株，K2型5株。PCR扩增毒力基因显示，所有hvKP均携带entB毒力基因，除毒力基因kpn、repA外，CRISPR-Cas系统阳性组携带毒力基因阳性率均大于CRISPRCas系统阴性组，其中毒力基因magA、kfuBC、wcaG、allS、aerobactin差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表2 耐药基因与菌株CRISPR-Cas 系统分布Table 2 The association between antibiotic resistance genes and CRISPR-Cas systems in hypervirulent K. pneumoniae isolates

表3 荚膜血清分型、毒力基因与菌株CRISPR-Cas 系统分布Table 3 The association between capsular serotypes， virulence genes and CRISPR-Cas systems in hypervirulent K. pneumoniae isolates

2.4 细菌毒力、MLST与CRISPR-Cas系统分布的关系

记录所有hvKP感染大蜡螟半数生存时间，生存曲线分析显示，CRISPR-Cas系统阳性组大蜡螟平均半数生存时间（h）少于CRISPR-Cas系统阴性组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MLST结果显示，21株携带I-E*型CRISPR-Cas系统的hvKP均为ST23型，而40株不携带CRISPR-Cas系统的hvKP ST11型31株，ST65型4株，ST86型2株，ST23型2株，ST1764型1株。见表4。

表4 细菌毒力、多位点序列分型与CRISPR-Cas 系统分布Table 4 Multilocus sequence typing （MLST） types and average survival time of the Galleria mellonella larvae after infection with hypervirulent K. pneumoniae isolates

3 讨论

目前认为CRISPR-Cas系统为细菌与古细菌中抵御外源病毒及质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统[13]。本研究分析临床hvKP CRISPR-Cas系统的分布，并尝试探究该系统对hvKP毒力及耐药的影 响。

本研究61株hvKP中CRISPR-Cas系统检出率为34.4%，高于Li等[4]30.7%和Lin等[7]12.4%的报道，且本研究中携带I-E*型CRISPR-Cas系统hvKP均为ST23型K1菌株，考虑CRISPR-Cas系统在某些菌株高度集中。毒力基因检测结果显示，CRISPR-Cas系统阳性组菌携带毒力基因阳性率大于CRISPRCas系统阴性组菌，其中毒力基因magA、kfuBC、wcaG、allS、aerobactin差异具有显著统计学意义；大蜡螟毒力实验结果显示CRISPR-Cas系统阳性组菌毒力明显强于CRISPR-Cas系统阴性组菌，差异具有统计学意义。以上实验结果表明CRISPRCas系统与hvKP毒力相对强弱密切相关，考虑可能I-E*型CRISPR-Cas系统与部分超hvKP克隆株紧密相关[14]。但毒力质粒pLVPK相关的毒力基因（terW、iutA、rmpA、silS和rmpA2），两组间未见统计学差异，CRISPR-Cas系统对毒力质粒未表现出剪辑作用，考虑原因可能是毒力质粒为部分超高毒力菌株所固有，并非外源性获得，机制需要进一步阐明。

61株hvKP药敏资料和耐药基因检测结果显示，CRISPR-Cas系统阴性组菌对各类抗菌药物耐药率均明显高于CRISPR-Cas系统阳性组，差异具有显著统计学意义，与Li等[4]报道相符。实验结果表明在hvKP中，CRISPR-Cas系统有效地限制了耐药基因的水平转移从而保持了细菌对抗菌药物的敏感性[15]。然而，对于耐药基因blaNDM-1，两组间未见统计学差异，而且在CRISPR-Cas系统阳性hvKP株中也可以检测到数个散在耐药基因，原因考虑有三：一是部分菌株中存在对抗CRISPR-Cas系统蛋白限制CRISPR-Cas系统功能发挥，二是部分菌株由于自身靶向间隔序列的存在导致CRISPRCas系统功能未活化，三是由于临床上碳青霉烯类药物滥用，而碳青霉烯类药物可以通过HNS调控压制CRISPR-Cas系统功能[7，16-17]。

本研究中MLST结果表明，hvKP CRISPR-Cas系统分布与MLST型别密切相关，所有携带I-E*型CRISPR-Cas系统均为ST23型，其他ST分型暂未检测到CRISPR-Cas系统的存在，MLST在一定程度上可以预测CRISPR-Cas系统的存在，这与Li等[4]报道相符。

61株hvKP中有39株为碳青霉烯类耐药hvKP（CR-hvKP），表明hvKP耐药也在愈益升高，其中CRISPR-Cas系统阳性只有5株，而CRISPR-Cas系统阴性有34株，其中ST11型31株，ST65 K2型2株，ST86 K2型1株，表明小部分“CR-hvKP”菌株来源于hvKP菌株获得耐药质粒，而大部分“CR-hvKP”菌株来源于CRKP菌株获得毒力质粒，这与Wyres等[14]报道“CR-hvKP”菌株进化来源相符。这也是导致本研究中感染“大部分”CRISPR-Cas系统阴性高毒力菌株患者30 d内病死率明显高于感染“小部分”CRISPR-Cas系统阳性菌株的主要原因，虽然CRISPR-Cas系统阳性hvKP平均毒力高于CRISPR-Cas系统阴性高毒力菌株，但CRISPR-Cas系统限制耐药质粒的获得，因此大部分CRISPR-Cas系统阳性菌株仍属于抗生素敏感菌株，经过临床及时抗感染治疗后仍有痊愈的希望，所以临床上更应该警惕世界流行的ST11型肺炎克雷伯菌，由于缺乏CRISPR-Cas系统对耐药基因的限制，非常容易形成泛耐药，一旦此类菌株进化获得毒力质粒pLVPK即可成为“CRhvKP”，对临床感染治疗与控制将是艰难挑战，或许CRISPR-Cas系统联合抗生素可以成为此类超级细菌有效杀菌制 剂。