车环宇 赵凌志 倪 雪 滕国生 车 翀

(通化师范学院医药学院，通化 134002)

帕金森病是除阿尔茨海默病之外最常见的一种神经退行性疾病，主要症状表现在身体和精神两方面，包括运动迟缓、震颤、肌强直、行走困难以及认知、睡眠和感觉障碍[1]。帕金森病的两个突出病理学特征就是中脑黑质多巴胺神经元的死亡和缺失，以及多巴胺神经元胞质包涵体路易小体的出现[2,3]。多巴胺神经元在帕金森病发展过程中的重要作用已被诸多研究所证实，但由于神经元的损伤是不可逆转的，对疾病的早期预防和治疗无益，因此，越来越多的研究开始关注引起多巴胺神经元损伤的原因。研究发现，多巴胺神经元的损伤与路易小体的形成密切相关，而路易小体的主要组成部分就是alpha-synuclein (α-syn)[4]。α-syn和帕金森病相关联的直接证据来自于α-syn蛋白中独立氨基酸位点的突变会引起家族性帕金森病[5,6]。遗传学证据表明，α-syn基因位点的复制同样会导致帕金森病的早期发生[6,7]。此外，某些易引起帕金森病的高危常染色体基因位点，和一些家族性PD相关的隐性基因位点通常位于α-syn基因的上游，它们的突变会导致α-syn蛋白的累积和毒性作用的增强，从而造成家族性和散发性帕金森病[8-11]。

在疾病的发展过程中，α-syn单体蛋白受内外因素影响产生错误折叠，继而发展成神经毒性较强的可溶性寡聚体，并最终聚合形成不溶的纤维前体和纤维体，从而引起脑内免疫紊乱，过度激活小胶质细胞释放炎症因子，损伤神经元细胞，导致帕金森病的产生[12-14]。因此，如何通过药物来抑制α-syn聚合，并通过药物介导α-syn聚合体在脑内的清除，就成为了预防和治疗帕金森病的新方向。但由于α-syn单体结构的多变性和α-syn聚合过程的复杂性，导致通过传统杂交瘤免疫和基因工程方法得到的抗体药物靶向性不强且药效不佳。为了获得真正具有疗效的帕金森病治疗性抗体，本文通过从外周血中分离培养B细胞的方法，对外周血中B细胞分泌的α-syn自身抗体进行了生物学功能方面的探索研究。

1 材料与方法

1.1材料 生物安全柜、CO2培养箱、高速冷冻离心机、酶标仪和384孔酶标板购自Thermo公司。洗板机购自Biotek公司。倒置显微镜购自Olympus公司。96孔细胞培养板和酶标板购自Corning公司。台盼蓝染料和IMDM 完全培养基购自Hyclone公司。胎牛血清购自Gibco公司。TMB、吐温-20购自Sigma公司。IL-2购自Sino biological公司。IL-21购自Thermo公司。无脂奶粉购自BD公司。庆大霉素购自Quality Biological公司。SepMateTM密度梯度离心管和EasySepTMHuman B Cell Enrichment 试剂盒购自Stem cell公司。Ficoll-Paque Plus购自GE公司。人α-synuclein单体、α-synuclein聚合体、β-synuclein、γ-synuclein和硫黄素T购自Abcam公司。羊抗人IgG Fc-HRP抗体购自Bethyl公司。

1.2方法

1.2.1人B细胞分离培养 首先按照Huang等[15]文章中提供的方法准备3T3-msCD40L滋养层细胞并冻存待用。健康人全血由捐赠者捐赠并通过项目伦理委员会批准。当获得健康人全血后，通过SepMateTM密度梯度离心管，按照使用说明，从全血中分离人外周血单核细胞(PBMC)，并进行PBMC细胞计数。随后使用EasySepTMHuman B Cell Enrichment试剂盒，按照试剂盒使用说明从PBMC中分离并富集B细胞，进行B细胞计数。计数后参照Huang等[15]文章中提供的方法，按照5 000个3T3-msCD40L滋养层细胞和4个B细胞每孔的密度铺于120块96孔细胞培养板中，并在每孔中加入200 μl 含104U/ml IL-2和100 μg/ml IL-21的IMDM完全培养基，将96孔板放置在37℃，5%CO2培养箱中静置培养13 d，取上清进行ELISA检测。

1.2.2ELISA检测B细胞上清和人α-syn单体和聚合体蛋白的结合活性 用pH9.2的包被缓冲液分别稀释α-syn单体和聚合体蛋白至1 μg/ml,以50 μl/孔包被于384孔酶标板，4℃孵育过夜。用110 μl/孔PBST(PBS+1%Tween-20)洗板1次后加入100 μl/孔的2% milk-PBS，在室温下封闭2 h。洗板3次后加入B细胞培养上清(20 μl/孔)，在室温条件下孵育1 h。随后洗板3次，再加入2% milk-PBS稀释10 000倍的山羊抗人IgG Fc-HRP二抗 (50 μl/孔)，室温下孵育1 h。洗板6次后用TMB显色试剂盒显色(30 μl/孔)，在室温条件下避光显色5 min后加2 mol/L H2SO4(30 μl/孔)终止显色。终止显色后立即用酶标仪在波长450 nm处测OD值。

1.2.3ELISA检测B细胞上清与人α、β、γ-synuclein蛋白家族的交叉实验 用pH9.2的包被缓冲液分别稀释α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein蛋白至1 μg/ml,包被于384孔板，4℃孵育过夜。洗板并封闭后加入B细胞培养上清(20 μl/孔)，在室温条件下孵育1 h。洗板后加入2% milk-PBS稀释10 000倍的山羊抗人IgG Fc-HRP二抗(50 μl/孔)，室温下孵育1 h。洗板后加30 μl/孔TMB显色液在室温避光条件下显色5 min，再加30 μl/孔H2SO4(2 mol/L)终止。随后立即用酶标仪在波长450 nm处测OD值。

1.2.4硫黄素T(ThT)法检测B细胞上清对α-syn单体聚合的抑制作用 参照Abcam提供的硫黄素T检测法，将新鲜配制的终浓度分别为10 nmol/L的α-syn聚合体、100 μmol/L的α-syn单体、25 μmol/L的硫黄素T及50 μl B细胞上清或同型对照抗体(人IgG1)或空白对照(PBS缓冲液)混匀于PBS(pH7.4)缓冲液中，以100 μl/孔(2复孔)加于96孔酶标板中，将板密封后置于振荡器上，以600 r/min的速率在室温孵育24 h。随后在酶标仪(激发光450 nm/发射光485 nm)上读取荧光值，通过以下公式计算检测的B细胞上清对α-syn单体聚合的抑制率，并通过graphpad6.0软件对数据进行统计学分析。抑制率=[(ThTblank-ThTsup)/(ThTblank)]×100%。

2 结果

2.1B细胞上清和人α-syn单体和聚合体蛋白的结合活性 从外周血分离的B细胞培养13 d后，离心将约200 μl的B细胞上清按照同样的顺序转到新的96孔板中用于ELISA和生物学活性检测。首先通过ELISA检测B细胞上清和α-syn单体蛋白的结合活性。ELISA共检测10 530个样品，其中OD450>0.5和OD450>1.0的B细胞上清样品分别有48和22个(图1A)。取α-syn单体蛋白结合OD450>0.5的48个上清样品进行和α-syn聚合体蛋白结合活性的ELISA检测，发现其中12个样品表现出只和α-syn单体结合，而不和α-syn聚合体结合。因为本次检测是基于α-syn单体检测阳性的基础上，因此所有剩余的36个样品既可以结合α-syn单体，也可以结合α-syn聚合体(图1B)。

图1 ELISA检测B细胞上清和α-syn单体和聚合体的结合活性Fig.1 ELISA test of binding of B cell supernatant to α-syn monomer and aggregateNote:A.48 in total 10 530 samples were able to bind to α-syn monomer and 36 of which bound to α-syn aggregate；B.There are 12 samples that bound to α-syn monomer only，but 36 samples bound to both α-syn monomer and α-syn aggregate.

2.2B细胞上清与人α、β、γ-synuclein家族蛋白的交叉结合活性 选取与α-syn单体和聚合体结合呈阳性的36个B细胞上清样品，通过ELISA检测上清样品是否和α-syn家族蛋白β-syn和γ-syn结合，以确定待测的上清样品是否具有α-syn结合特异性。检测结果表明，所有检测样品均与α-syn结合，但不结合β-syn和γ-syn蛋白，表明检测的上清样品具有α-syn结合特异性。

2.3B细胞上清中α-syn自身抗体对α-syn聚合的抑制作用 选取与α-syn单体和聚合体结合呈阳性，且无家族蛋白交叉活性的36个B细胞上清样品，通过硫黄素T法检测B细胞上清中α-syn自身抗体是否具有抑制α-syn单体聚合的生物学活性。实验结果表明，所检测的36个样品中有9个样品(18B03、24D09、25G07、41H11、55F02、84C06、85F02、87C04、96C05)能够抑制α-syn单体的聚合，且具有显著的统计学意义(图2)。其中如表1所示，25G07和55F02的抑制率可以达到50%。

图2 硫黄素T法检测B细胞上清中α-syn自身抗体对α-syn聚合的抑制作用Fig.2 Inhibition test of α-syn aggregation by α-syn autoantibody in B cell supernatant using ThT assayNote:*.P<0.05，**.P<0.01,****.P<0.000 1.

表1 所检测的B细胞上清对α-syn聚合的抑制率(%)Tab.1 Inhibition ratio (%) of α-syn aggregation by α-syn autoantibody in B cell supernatant

3 讨论

本文通过从外周血中分离培养B细胞并检测B细胞上清中α-syn自身抗体和α-syn单体、聚合体、家族蛋白β-syn和γ-syn的结合，确认了外周血中α-syn自身抗体能够特异地和α-syn单体和聚合体结合。通过抑制α-syn单体聚合的生物学活性检测，发现α-syn自身抗体具有一定的生物学功能，在体外条件下能够抑制α-syn单体的聚合，证明了α-syn自身抗体具有潜在的治疗PD的应用价值。

在本研究中，出于B细胞存活率考虑，B细胞的铺板密度维持在4个B细胞每孔。在早期研究中，尝试过0.5、1和2个B细胞每孔的铺板密度，但是过少的B细胞会造成细胞增殖困难。在2个B细胞每孔的铺板条件下，B细胞增殖率(细胞增殖孔/总铺板孔数)可以达到70%～80%，但后期上清IgG浓度检测发现2个B细胞每孔的上清IgG浓度在10～80 ng/ml之间，抗体量不足以进行生物学活性检测。即使在4个B细胞每孔的条件下，上清中的抗体量也不足以支撑9个生物学阳性样品的进一步检测。在后续实验中，可以通过B细胞永生化的途径，在筛选前期，即对α-syn结合阳性的B细胞进行Epstein-Barr virus(EBV)转染，使B细胞成为可以持续分泌抗体的永生化细胞[16]。此外，也可以通过流式细胞仪对B细胞进行抗原特异性分选，收集能够和α-syn抗原特异性结合的记忆B细胞，通过RT-PCR和测序的方法获得抗体序列，进行质粒转染和表达来获得足量的抗体[17-20]。如果能够获得足够的抗体，下一步可以继续研究外周B细胞分泌的α-syn自身抗体是否可以介导α-syn聚合体在体内的清除，从而进一步分析α-syn自身抗体的生物学功能，为PD治疗性抗体的研发打下基础。此外，本研究所采集的血液样本来自于健康人捐献者，后期研究可以考虑应用不同年龄阶层的健康人和PD患者。从而比较健康人和PD患者之间，以及不同年龄健康人群之间产生自身抗体的差别。这些差别将有助于分析自身抗体产生的机制，并深入研究PD疾病的发生机理，从而对PD抗体药物的研发起到推动作用。

在其他领域的研究中，有大量利用自身抗体创制出治疗性抗体的成功经验[16,17]。从机制上说，在正常生理条件下，自身抗体作为固有免疫的产物，起到维持体内生理平衡、清除循环系统中的异常蛋白和死亡细胞及保护机体的作用[21,22]。但是在病理条件下，自身抗体的产生很可能是源于体内的异常蛋白，并且具有清除异常蛋白的生理功能。而且，本文也通过技术手段，证明了通过分离培养外周血B细胞获得的α-syn自身抗体是具有一定生物学功能的。总体来说，自身抗体作为创制α-syn治疗抗体的新途径，较其他途径有着独特的优势。首先，自身抗体靶向体内α-syn异常蛋白，对正常α-syn蛋白不结合或较弱结合，不会影响正常α-syn蛋白的生理功能。其次，对于α-syn蛋白来说，蛋白的缺失只造成了α-syn基因敲除小鼠黑质纹状体多巴胺途径的微弱障碍，并没有影响到基因敲除小鼠的其他生理功能[23]。由此推测，α-syn抗体的应用不会造成对正常神经组织的副作用。综上所述，来源于自身抗体的PD治疗抗体相对于目前市面上治疗PD的药物来说，将具有更高的靶向性和安全性，是研究治疗PD疾病药物的新方向。