刘建春 张红珍 郭文娟 柴 智 尉杰忠 于婧文 肖保国 马存根

(山西中医药大学神经生物学研究中心，国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点实验室，晋中 030619)

多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一种发生于中枢神经系统(CNS)的自身免疫性疾病，炎症反应和随后发生的神经元凋亡为 MS 的两大重要病理特征[1]。近年来，在全球范围内 MS 的发病率逐年上升，但是对于 MS 的发病原因尚不明确，目前缺乏特效药[2]。现代医学治疗 MS 主要集中于抗炎和免疫调节的方法，虽然可以在一定程度上缓解病情，但有些药物副作用很大[3]。因此，寻找一种更安全有效的药物，是当前MS研究亟待解决的问题。

气虚血瘀证是 MS 中医辩证论治中常见证型之一，结合病症 MS 的治疗应采用以补气、活血、通络为主的益气活血法[4]。黄芪为山西省的道地药材之一，我国常用补气中药，黄酮类成分为其重要的化学组成之一，近年来药理研究表明黄芪中黄酮类成分具有抗氧化、抗肿瘤、神经保护等作用[5，6]。Astragaloside 是从黄芪中提取的黄酮类单体，本研究发挥地方资源优势，以 MS经典的动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠为研究对象，探讨黄芪中有效成分 Astragaloside 对 EAE 的保护作用及机制，以期为临床有效防治多发性硬化等神经系统自身免疫性疾病提供科学、可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 8～10周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验前小鼠自由饮食喂养1周，饲养环境为25℃左右的无病原菌清洁级动物房。

1.1.2药物及试剂 Astragaloside (CAS No.17429-69-5)购自爱必信(上海)生物科技有限公司(货号 abs 47006901)；小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽35-55(Myelin oligodendrocyte glycoproten，MOG35-55)购自上海强耀生物科技有限公司(批号：9001)；百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)购自美国Sigma公司(批号：231144)；结核分枝杆菌(Tuberculosis mycobacter ium，TB)购自美国Becton Dickinson公司(批号：231141)；完全弗氏佐剂(Complete freund’s adjuvant，CFA)购自美国Alexis公司。IL-1β、IL-10、IL-17、TNF-α酶联免疫分析(ELISA)检测试剂盒均购自上海生物工程有限公司； Western blot抗体：β肌动蛋白(β-actin)(批号：4870S)、p-MYPT1 购自美国Cell Signaling公司(批号：4563)；p-NF-κB/p65(批号:ab86299)、ROCKⅡ(批号ab1250 25)购自英国abcam 公司。

1.1.3仪器 凝胶电泳仪(Bio-Rad ，型号：PowerPacTM)；凝胶成像分析仪(Bio-Rad，型号：HOOD-Ⅱ)；CO2培养箱(Thermo，型号：3131)；高速冷冻离心机(Eppendorf，型号：5840)；酶标仪(北京普朗新技术有限公司，型号：DNM-9602)；洗板机(芬兰Thermo Labsystems ，型号：AC8)。

1.2方法

1.2.1EAE小鼠模型制备 MOG35-55抗原乳剂的配制和注射均严格按照文献[7]的方法进行。

具体方法：MOG35-55浓度为250 μg/只，TB 浓度为350 μg/只，用生理盐水配制MOG35-55，用完全弗氏佐剂配制TB，使用针管混合器将水剂和油剂1∶1充分混合，反复抽推,制成抗原乳剂，小鼠按 0.1 ml/只于脊柱两侧皮下4 个点分别注射抗原乳剂。将免疫当天记为免疫后的第 0 天。在免疫当日和免疫后的第2天，每只小鼠腹腔注射百日咳毒素(PTX)300 ng/只。小鼠出现尾部肌张力下降症状为EAE发病起始，即模型制备成功[8]。

1.2.2分组及给药 C57BL/6 雌性小鼠按平均体质量随机分为 3 组：EAE对照组、Astragaloside 高剂量组和Astragaloside 低剂量组，每组6只。免疫后第3天开始给药，给药剂量为0.2 ml/(次·只)，EAE 对照组给予PBS；Astragaloside 高剂量组和Astragaloside 低剂量组分别给予黄芪甲苷溶液 30 mg/(kg·d)，15 mg/(kg·d)，持续给药直至免疫后第27天。

1.2.3行为学检测 在免疫后第0天开始每天定时观察及评估小鼠症状、体征、体重变化和临床评分，EAE临床症状评分按照目前国际通用的5分法[8]：正常：0分；轻度步态笨拙，尾部张力消失：1分；步态蹒跚，单肢无力，被动翻身后仍可以复位：2分；双肢瘫痪，但给予刺激后可以挪动：3分；四肢瘫痪：4分；濒临死亡或死亡：5分。症状介于两个评分标准之间，以±0.5分计。

1.2.4标本制备 在免疫后第28天，各组小鼠摘除一只眼球采血，制备血清；随机取 EAE 组和Astragaloside 3只小鼠，采用10%水合氯醛(0.2 ml/只)腹腔注射麻醉，每组取3只推注PBS进行心脏灌注，同时在冰上快速取小鼠脊髓和脑组织，冰上裂解，4℃离心提取蛋白，定量后采用 Western blot 技术检测ROCKⅡ、P-MYPT1和p-NF-κB/p65的表达。各组其余3只小鼠推注PBS至肝脏发白，再推注 4%多聚甲醛进行体内组织固定。然后分离脊髓和脑，制作冷冻切片，冰切厚度10 μm，进行HE染色。

1.2.5HE染色 在蒸馏水中浸润脊髓冰冻切片2 min，按照说明书，在切片上分别滴加苏木精染液和伊红染液进行染色，梯度乙醇脱水，70%乙醇中1 min，70%乙醇中1 min，80%乙醇中1 min，90%乙醇中1 min，95%乙醇中1 min，100%乙醇中1 min，100%乙醇中 2 min；二甲苯透明5 min，用中性树胶封片,镜检，拍照。

1.2.6ELISA法检测外周血中细胞因子的表达量 采用ELISA试剂盒对细胞因子IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-10浓度进行检测，检测方法严格参照说明书执行。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。以标准物的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，计算出标准曲线的多项式二次回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.2.7Western blot法检测脊髓组织中ROCKⅡ、P-MYPT1和p-NF-κB/p65 的表达变化 提取脊髓组织蛋白，用 BCA 法蛋白定量后，加入蛋白上样缓冲液煮蛋白，用微量加样器加入40 μg煮好的蛋白样品。用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。电泳完毕后，湿转到硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭 2 h，按照说明书，加入一定比例的一抗 ROCK-Ⅱ、P-MYPT1、p-NF-κB/p65、β-actin，4℃ 过夜；次日洗涤后，用封闭液稀释相应的HRP标记偶联二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床室温孵育2 h。洗膜后进行化学发光反应，用凝胶成像仪检测条带，用BandScan分析灰度值与内参的灰度值比值比较，并进行统计学分析。

2 结果

2.1小鼠发病时间、临床评分和体重变化 Astragaloside 高、低剂量组均可延迟EAE发病，EAE对照组在免疫后第 8 天开始发病，Astragaloside 低剂量组、Astragaloside 高剂量组分别在免疫后第10天、12天开始发病。EAE对照组平均起病时间为(11.5±0.8)d，Astragaloside 高、低剂量组平均起病时间分别为(14.5±1.12)d，(12.5±1.12)d，与EAE对照组和Astragaloside 低剂量组比较，Astragaloside 高剂量组明显延迟了EAE发病(图1A，表1)。体重变化的结果显示，EAE 对照组随着临床症状的加重，体重明显减轻，Astragaloside 高、低剂量组在改善临床症状的同时，体重减轻较少(图1B)。临床症状曲线清晰地显示，与 EAE对照组比较，Astragaloside 高剂量组在免疫后13～27 d，Astragaloside 低剂量组在免疫后13～18 d，临床评分显著降低(P<0.01，P<0.001)(图1A)；EAE对照组平均最高临床评分为(2.6±0.97)分；Astragaloside 高、低剂量组平均最高临床评分分别为(0.75±0.56)分，(1.08±0.61)分；与EAE对照组比较，Astragaloside 高、低剂量组均可明显降低平均最高临床评分，减轻EAE临床症状(P<0.01，P<0.05)(图2B，表1)。

上述结果表明，Astragaloside高、低剂量组均能延迟EAE发病，缩短病程，减缓EAE临床症状，As-tragaloside 30 mg/(kg·d)为治疗EAE的有效剂量。因此后续实验以高剂量为给药剂量进行实验。

图1 小鼠临床评分和体重的变化Fig.1 Changes in clinical scores and body weight of miceNote:Compared with EAE control group,**.P<0.01,***.P<0.001.

表1 小鼠平均起病时间、平均最高临床评分的变化

图2 小鼠平均起病时间和平均最高临床评分的变化Fig.2 Changes in mean onset time and highest mean clinical score of miceNote:Compared with EAE control group,*.P<0.05，**.P<0.01.

2.2Astragaloside对脊髓炎症细胞浸润的影响 HE染色显示，EAE对照组小鼠脊髓白质区炎症细胞成大片点状分布，血管周围炎症细胞浸润呈袖套样改变，而 Astragaloside 组几乎无炎症细胞浸润，Astragaloside 可抑制脊髓炎症细胞浸润(图3)。

图3 小鼠脊髓组织中炎性细胞浸润的情况(HE染色)Fig.3 Inflammatory cell infiltration in mouse spinal cord (HE staining)

2.3Astragaloside对血清中细胞因子的影响 与EAE对照组比较，Astragaloside可显著降低血清中IL-1β、IL-17的表达(P<0.05，P<0.001)，增加血清IL-10水平(P<0.05)，对血清TNF-α水平有下调趋势 (图4)。

图4 小鼠血清中细胞因子的变化Fig.4 Changes of cytokines in serum of miceNote:Compared with EAE control group,*.P<0.05，***.P<0.001.

2.4EAE小鼠脊髓组织ROCKⅡ、P-MYPT1、p-NF-κB/p65 的表达变化 与EAE对照组比较，Astragaloside组ROCKⅡ、P-MYPT1、p-NF-κB/p65在脊髓的表达明显得到抑制(P<0.05)(图5)。

图5 小鼠脊髓组织ROCKⅡ、P-MYPT1、p-NF-κB/p65 的表达变化Fig.5 Expression of ROCKⅡ，P-MYPT1 and p-NF-κB/p65 in Spinal cord of miceNote:Compared with EAE control group,*.P<0.05.

3 讨论

MS是一种发生在中枢神经系统的免疫介导性疾病，炎性脱髓鞘与神经退行性变是其主要的病理特征[9]。其病因和发病机理目前尚不完全清楚[10-12]。治疗方面，迄今为止，尚未发现可以治愈MS的理想药物[13]。

中医药以多靶点、多途径、整体调节的特点在延缓MS进程方面有着独特的优势。气虚血瘀证是 MS 的一个重要证候要素之一[14]。黄芪为我国常用益气中药，近年来研究表明，黄芪中黄酮类成分具有抗炎、免疫调节和神经保护等功效[3，15]。Astragal-oside 是从黄芪中分离得到的一种单体黄酮苷，本研究在免疫后第 3 天给予 Astragaloside 干预治疗，结果显示，Astragaloside 高、低剂量组均可明显降低临床评分，减轻EAE临床症状，Astragaloside以30 mg/(kg·d)为有效剂量。外周免疫的炎症细胞向中枢迁移的多少与 EAE 疾病发病的严重程度密切相关。因此，我们采用HE染色分析了脊髓组织的免疫细胞浸润情况，病理结果证实，Astragaloside可抑制脊髓炎性细胞浸润。

MS/EAE 最主要的发病机制是免疫失衡[16，17]，其病理过程涉及多种免疫活性细胞，CD4+T 细胞介导的免疫反应起主要作用。初始CD4+T 细胞在抗原的刺激下，在不同的条件下可分化成不同亚型的效应T细胞，包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)等[18]，执行不同的功能。Th1细胞活化后分泌TNF-α、IL-1β、IFN-γ 等促炎细胞因子；Th2 细胞则主要分泌IL-4、IL-10 等抑炎细胞因子，可以抑制免疫反应；Th17细胞能够分泌促炎症因子IL-17，Meta 分析结果显示，血清IL-17水平与脱髓鞘神经疾病 MS 具有明显的相关性，MS 患者血清IL-17 水平明显高于健康人群[19]。本实验的ELISA检测结果显示，Astragaloside可通过显著降低血清中IL-1β、IL-17的表达，增加血清IL-10水平，从而抑制中枢神经系统炎症细胞浸润。

Rho激酶(ROCK)信号通路是生物体中广泛存在的经典信号通路，参与多种生理调节过程。在中枢神经系统中，Rho/ROCKⅡ信号主要涉及神经元的形态发生、轴突和树突的生长与数量、树突重塑、轴突导向、突触的结构与功能，以及神经细胞的损伤、修复与凋亡[20，21]。ROCK信号通路的激活与 MS/EAE 的发生、发展密切相关。磷酸化的肌球蛋白磷脂酶-靶向亚基1(p-MYPT1)是ROCK作用的底物，p-MYPT1水平的高低直接显示ROCK在体内的活性水平[22]。我们通过Western blot方法对脊髓ROCKⅡ、p-MYPT1以及p-NF-κB/p65进行了检测，实验结果显示，Astragaloside能明显降低MYPT1 的磷酸化程度，抑制p-NF-κB/p65的表达，对ROCK活化起到抑制作用。

综上所述，Astragaloside 治疗EAE可明显改善EAE临床症状、抑制炎症细胞浸润，可能与其调节细胞因子的分泌，抑制ROCK通路的激活有关，为进一步研究MS等自身免疫性疾病打下实验基础，也为山西道地药材黄芪的开发利用提供了科学依据。