丁 童 贠 霄 周彦鹏 杨卫强 冯立平

(新乡市中心医院创伤外科，新乡 453000)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种关节软骨和骨连接处损伤的关节疾病,最主要的症状为关节疼痛和僵硬，并伴有关节肿痛，活动受限，四肢麻木等[1]。骨关节炎为最常见的关节疾病，影响着大约2.37亿人(约占总人口的3.3%)[2]。在超过60岁的老年人口中，大约有10%的男性和18%的女性受到关节炎的折磨[1]。既往研究报道，miR-137在多种肿瘤中表达下降，并且可以作为肿瘤预后的诊断分子，如肺癌、结肠癌、口腔鳞状细胞癌等[3,4]。另一方面，miR-137还可以通过靶向MK2基因来抑制炎症应答和细胞凋亡来保护脊柱神经损伤[5]。另外还有研究证明，在人类及小鼠的生长发育过程中，miR-137具有促进神经干细胞分化的作用[6]，同时IL-1β还在OA的发生发展中具有重要作用，如IL-1β可以促进滑膜细胞和关节软骨细胞释放中性蛋白酶和前列腺素E2，这些因子通过刺激关节细胞发生关节炎症，而导致关节发生退行性关节炎[7]。但是针对OA发生发展涉及miR-137和IL-1β相关的信号机制研究结果鲜有报道，因此我们根据既往的研究结果，利用IL-1β诱导的大鼠软骨细胞炎症反应为研究体系，对软骨细胞中可能对细胞命运产生影响的miR-137机制进行深入探究，期望为软骨细胞炎症的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 DMEM细胞培养液、胎牛血清和胰酶均购自美国Gibco公司。转染试剂盒Lipofecta-mine3000(货号：L3000008)购自Thermo公司。IL-1β(货号：ab119727)、BMP2(货号：ab14933)、CollagenⅠ(货号：ab34710)、Beclin-1(货号：ab207612)、P62(货号：ab56416)、LC3A/B(货号：ab128025)、β-actin(货号：ab124964)一抗购自美国abcam公司。HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司。SYBR PCR Master Mix(货号：4309155)购自赛默飞公司。IL-6(货号：E-EL-M0044c)、iNOS(货号：E-EL-R0520c)、TNF-α(货号：E-EL-R0019c) BGP(货号：E-EL-R0243c)、ALP(货号：E-BC-K091)ELISA试剂盒购自Elabscience公司。3月龄SD雌性大鼠，体重(260±20)g，购自北京维通利华。所有实验操作均遵从于《实验动物管理条例》。

1.2方法

1.2.1大鼠原代软骨细胞分离 将3月龄SD雌性大鼠，膝关节软骨于无菌环境下取出，放进无菌操作台，使用PBS冲洗3次，剔除非软骨组织。用PBS再次清洗后放入离心管中，加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱30 min后取出终止消化，去除成纤维细胞；将样品转入加有PBS的培养皿中，使用无菌剪将软骨剪成1 mm3的碎块，经PBS洗涤3次后加入胶原酶Ⅱ在37℃摇床中消化至悬液浑浊。样品再经100 μm细胞筛过滤，收集滤液，1 000 r/min离心10 min，弃掉上清，PBS清洗3次，1 000 r/min离心5 min收集细胞，按照1×107个/皿接种至10 cm 培养皿中，37℃正常培养。

1.2.2软骨细胞转染 软骨细胞铺板24 h后换液，使用Lipofectamine 3000(μl)∶待转DNA(μg)=4∶1。按照分组进行相应转染处理(细胞随机分为5组,即Ctrl组，scramble组，IL-1β组，mimic组和mimic+IL-1β组。其中空白对照组正常细胞培养;scramble组细胞转染scrambleRNA； IL-1β组细胞用10 μmol/L IL-1β处理；mimic组细胞转染miR-137mimic；mimic+IL-1β组细胞转染和miR-137mimic 并接受IL-1β处理)。转染48 h后收集细胞待用。显微镜下(随机挑选5个视野进行统计)得瞬时细胞转染率约为70%。

1.2.3qRT-PCR检测软骨细胞中相关RNA水平 取转染后的软骨细胞，待细胞处于对数生长期时，用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度、纯度后，用反转录试剂盒合成cDNA，用PCR仪进行扩增，用SYBR PCR Master Mix试剂盒对miR-137表达水平进行检测，以GAPDH为内参。实验所用引物均采用Primer 3 Plus网站设计，由苏州金唯智生物科技有限公司合成，重复3次。

1.2.4Western blot检测细胞中蛋白表达 收集细胞，PBS清洗3次，用添加有终浓度为1 mmol/L的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的细胞裂解液进行裂解，提取各组细胞总蛋白。用BCA试剂盒检测总蛋白浓度(具体检测按照试剂说明书进行)，10%SDS-PAGE胶分离蛋白后用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗于4℃封闭过夜，第二天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL曝光显影。显色并统计灰度值计算相对表达量。

1.2.5ELISA检测炎症因子 胰酶消化细胞收集后，低温离心机800 r/min离心8 min，将收集细胞进行冷PBS洗涤3次；将细胞处于-20℃与室温之间进行反复冻融3次后于1 500 g离心10 min收集上清液供实验使用。加样设置：分别设空白孔，标准品孔，待测样品孔。酶标包被的板子上加标准品50 μl，先加入样品稀释液40 μl于待测样品孔，然后加待测样品10 μl。孵育：封板后置于37℃环境进行30 min孵育。液体配置：把30×洗涤母液经蒸馏水稀释30倍备用。洗涤：缓慢揭掉封板膜，将液体弃去，甩干液体，每孔加洗涤液，放置30 s之后弃去，重复5次，拍干板子。加酶：每孔加酶标试剂50 μl，空白孔不加。孵育：再次封板后放37℃孵育30 min。洗涤：小心取掉封板膜，甩去液体，甩干液体，每孔加适量洗涤液，放置30 s之后弃去，重复5次，拍干板子。显色：各孔加入显色剂A液50 μl，再加显色剂B液50 μl缓慢振荡混匀后，37℃避光进行显色10 min。终止：各孔加入50 μl终止反应液，反应终止(终止后蓝色立即转为黄色)。测定：用空白孔进行调零，450 nm波长下依次测量每孔吸光值(OD值)。测定应在加入终止液后的15 min内进行。

1.2.6免疫荧光 操作步骤按照说明书进行，细胞接种于预先用0.01%多聚赖氨酸包被的盖玻片，经药物处理后，加入4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗，用含Triton X-100封闭液在冰上通透5 min；吸掉通透液，加入预温的封闭液，室温下封闭1 h；孵育一抗4℃过夜。次日，PBS漂洗，孵育荧光标记的二抗(浓度为1∶200)，室温避光孵育1 h，PBS漂洗，50%甘油-指甲油封片，立即避光共聚焦显微镜观察。

2 结果

2.1miR-137在不同处理组中差异表达 经过细胞瞬时转染及添加IL-1β后miR-137表达水平：与空白Ctrl组比较，阴性对照scramble组miR-137表达水平无显著差异(因此后续实验不再添加Ctrl组比较)；与scramble组比较，单独添加IL-1β组miR-137表达水平显著下调(P<0.01，图1)；而miR-137 mimic组中miR-137表达水平则明显上升。

图1 miR-137在不同处理组中表达差异Fig.1 Expression of miR-137 was detected in chondro-cytes among different groupsNote:The expression of miR-137 was detected by qRT-PCR.Data shown are the means of each group.**.P<0.01 compared with the scramble group.Bars,SEs.

2.2miR-137对BGP和ALP表达的影响 细胞经过瞬时转染各组外源核酸及IL-1β后，经过ELISA检测BGP和ALP表达水平发现：miR-137 mimic组与scramble组之间BGP和ALP表达水平没有显著差异；但是经过IL-1β处理后，BGP和ALP表达受到显著的下调(P<0.01，图2)；与IL-1β组比较，mimic+IL-1β组BGP和ALP表达水平得到一定的补偿，差异具有统计学意义(P<0.01，图2)。

图2 ELISA检测软骨细胞中BGP和ALP表水平Fig.2 Expression of BGP and ALP were detected by ELISANote:Data are expressed as compared with the mimic group;##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

2.3miR-137 促进软骨细胞中软骨功能相关蛋白表达 经过Western blot检测各组处理后的组织细胞发现：mimic组软骨细胞中BMP2和CollagenⅠ表达量与scramble组之间无显著差异；但是经过IL-1β处理后，BMP2和CollagenⅠ表达水平显著下调(P<0.01，图3)；而mimic+IL-1β组软骨细胞中BMP2和CollagenⅠ表达量则有所恢复，相对于IL-1β组差异具有显著的统计学意义(P<0.01，图3)。

图3 Western blot检测各处理组软骨细胞中BMP2和CollagenⅠ表达水平Fig.3 BMP2 and CollagenⅠ were detected by Western blot in each group of chondrocytesNote:BMP2 and CollagenⅠ were detected using Western blot analysis.Data are expressed as compared with the mimic group；##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

2.4miR-137抑制软骨组织细胞中炎症因子表达 各组细胞经过相应处理后利用ELISA检测相关炎症因子发现：与scramble组相比，mimic组软骨细胞内炎症因子IL-6、iNOS和TNF-α水平无显著差异；与mimic组相比，IL-1β处理后的软骨细胞中相关炎症因子表达水平发生明显的上调(P<0.01，图4)；mimic+IL-1β组软骨细胞中相关炎症因子表达水平受到显著抑制(P<0.01，图4)。

图4 ELISA检测各处理组中软骨细胞炎症因子表达水平Fig.4 Expression of inflammatory factors were detected in each group of chondrocytesNote:IL-6,iNOS and TNF-α were detected using ELISA.Data are expressed as compared with the mimic group；##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

2.5miR-137抑制软骨细胞中自噬相关蛋白质的表达 Western blot检测各组软骨细胞中自噬相关蛋白质分子发现：与scramble组细胞相比，mimic组细胞中自噬相关的Beclin-1、P62和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平没有显著性差异；与mimic组细胞表达水平相比，IL-1β组细胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平发生显著上调，而P62表达水平发生明显下调(P<0.01，图5)；与IL-1β组相比，mimic+IL-1β组中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平受到了明显的下调，而P62的表达水平则显著上调(P<0.01，图5)。免疫荧光染色鉴定细胞内LC3+细胞显示：与scramble组比较，mimic组LC3+细胞含量和数量之间没有显著性差异；与mimic组相比，IL-1β组LC3+细胞中发现大量的绿色荧光，并且几乎所有的细胞中都有分布；与IL-1β组相比，mimic+IL-1β组中LC3阳性的数量相对减少，荧光亮度减弱，并且差异具有统计学意义(P<0.01，图5)。

图5 Western blot和免疫荧光技术检测各处理细胞自噬相关分子表达和分布情况Fig.5 Expression and distribution of autophagy-related proteins were detected by Western blot and immunofluorence in each group of chondrocytesNote:The autophagy markers were detected by Western blot.The LC3+were detected by the immunofluorence.Data are expressed as the compared with the mimic group；##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

3 讨论

OA是被公认的最常见的致残影响因素之一，会伴随着长期慢性疼痛并降低运动耐受能力[8,9]。OA形成的诸多风险因素主要包括：体重，年龄，女性，关节受损、过度使用，肌肉和韧带无力等[10]。关节软骨内唯一具有功能的软骨细胞数目及稳定的功能对维持软骨基质合成、软骨稳态和降解平衡有着至关重要的作用。OA发生的同时，炎症因子、异常力学刺激等都会使软骨局部微环境发生变化，导致软骨细胞功能异常、肥大、数目减少，软骨基质合成能力减弱，聚蛋白多糖分泌减少，基质降解酶(金属基质降解酶：Matrix Metalloproteinases，MMPs)等表达增加，促使软骨基质降解[11]。

miR-137虽然在多种肿瘤中表达下降，可以作为肿瘤治疗预后的诊断分子[3,4]，同时miR-137还可以通过靶向MK2基因来抑制炎症应答和细胞凋亡来保护脊柱神经损伤[5]。说明miR-137具有一定的炎症抑制作用。有研究报道，IRF1和NF-κB依赖的iNOS激活可以产生炎症反应，从而产生大量的炎症因子，如促炎因子IL-1、TNF-α和干扰素γ等[12]。一般机体诱导产生大量的iNOS通常是在氧化环境中，高表达水平的NO通常会与超氧化物发生反应，导致过氧化亚硝基产物产生细胞毒性[13]。本研究发现，经过IL-1β处理后的软骨细胞表达大量炎症因子IL-6、iNOS和TNF-α；但是经过miR-137 mimic处理后得到了明显改善，证明miR-137可以有效抑制软骨细胞炎症的分泌。

细胞自噬对于软骨细胞具有两面性作用：既可以作为细胞中细胞器组建的原材料供应者，也就是细胞结构经过自噬后再循环利用，来保证细胞常态下代谢活动的高效利用；又可以因为外部环境不适，造成细胞自噬依赖的程序性死亡异常启动，造成这一现象差异的原因可能是因为疾病不同进展阶段造成的影响，或是生理病理状态导致的差异而形成不同的自噬作用[14]。另据文献报道，miR-137可以通过靶向ATG7的表达来抑制饥饿诱导的自噬现象[15]。我们研究发现在scramble组正常表达的基础上，IL-1β组软骨细胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ发生明显的上调，P62发生下调；说明软骨细胞内发生了自噬作用来响应IL-1β的刺激，并有进一步发生自噬性凋亡的趋势；但是在miR-137+IL-1β组中，自噬相关蛋白表达水平又有一定的下调趋势，说明miR-137可以有效抑制软骨细胞中自噬进展，保护细胞免受凋亡的影响。

当然，软骨细胞炎症的发生发展具有十分复杂的特点，而且据报道自噬在其中发挥调节的方式也不尽相同[14]。根据研究结果显示，IL-1β诱导产生的软骨细胞炎症发生了强烈的自噬现象，说明细胞命运更加趋向于自噬依赖性的程序性死亡。细胞代偿性增加自噬作用有利于细胞生存，但是若持续性增加自噬作用细胞便会受到损害而发生凋亡[14-20]。因此针对该项实验方案还需要进一步探究相关凋亡通路活性来验证自噬和凋亡之间的相互作用关系；并进一步深入探究IL-1β在该软骨细胞炎症诱导模型中的信号机制。

综上，miR-137可以在IL-1β诱导的软骨细胞炎症反应体系中有效降低细胞炎症反应和细胞自噬水平，并可以刺激细胞分泌大量的BMP2和CollagenⅠ，来发挥软骨细胞生理活性功能。miR-137这种对软骨细胞炎症的保护效果为骨关节炎症的治疗提供了一种全新的参考形式。但是涉及microRNAs的调控通路众多而复杂，明确具体信号调控机制才能为临床精准化治疗骨关节炎提供指导依据。