穆永亮 赵华俊 张 建 韩秋菊

(山东大学药学院免疫药物学研究所，济南 250012)

肿瘤微环境是癌细胞赖以生存和维持恶性增殖的内环境，呈现明显的免疫抑制状态[1]。利用细胞因子增强机体免疫应答、破坏肿瘤细胞的免疫逃逸状态，成为肿瘤生物治疗的重要策略之一。其中，IL-12尤为引人关注，被认为具有应用于临床治疗肿瘤的潜力[2,3]。

IL-12是由 p35、p40 两个亚基共同组成的异源二聚体，主要由树突状细胞、巨噬细胞分泌，能够诱导T细胞、NK细胞的激活，在临床上已被用于黑色素瘤、肾细胞腺癌等多种疾病的辅助治疗[4]。然而，在临床应用过程中，人们逐渐关注到全身使用IL-12治疗可引起明显的毒副作用，并且IL-12半衰期较短，停药后疗效迅速消失[5,6]。

多年来，研究者致力于改造IL-12或者通过改变给药途径/部位以降低毒副作用。有科学家通过删除IL-12单链的N末端对其结构进行改造，利用靶向肿瘤的溶瘤腺病毒作为载体，在胰腺癌治疗中取得了良好的效果，且没有显著的毒副作用[7]。也有研究发现，瘤内注射表达IL-12的质粒(pIL-12)能够控制IL-12的局部表达，并激活肿瘤微环境中免疫应答，进而发挥抗肿瘤作用，并且降低了IL-12的副作用。2017年FDA批准pIL-12为治疗不可切除转移性黑色素瘤的罕见药[8]。

本研究中，我们首先将mIL-12-PsecTag过表达质粒转染入小鼠来源的肝癌细胞系Hepa1-6中，观察肝癌细胞生物学特性的变化，进一步利用小鼠体内实验探索过表达IL-12的抗肿瘤作用和免疫激活作用，为进一步探讨IL-12基因治疗肝癌提供必要的实验数据。

1 材料与方法

1.1材料 C57BL/6小鼠购于北京华阜康生物科技股份有限公司。鼠肝癌细胞系Hepa1-6购于中国科学院上海细胞库。DMEM培养基购自Hyclone公司；胰酶购自Sagon上海股份有限公司；新生胎牛血清购自天津瀞洋科技有限公司；mIL-12-PsecTag过表达质粒由本实验室构建；mIL-12 ELISA 试剂盒购自联科生物技术公司；LipoTM2000脂质体购自Invitrogen；Trizol购自Invitrogen公司；Sybr Green Mix购于Roche生物有限公司；CCK-8和总蛋白提取试剂盒购自碧云天生物公司；引物由上海派森诺生物科技股份有限公司；anti-CD3、anti-NK1.1、anti-CD8、anti-IFN-γ、anti-TNF-α、anti-PD-L1、anti-CD69等抗体购自eBioscience 公司；pSTAT1、STAT1抗体及HRP羊抗兔二抗均购自CST公司。

1.2方法

1.2.1质粒转染 取对数生长期细胞接种于6孔板中(1×106个)，培养过夜。次日，更换无血清培养基。将2 μg质粒加至250 μl无血清培基中混匀，同时将 4 μl Lipo-2000脂质体加至另外250 μl无血清培基中，轻吹混匀，室温静置5 min。将DNA悬液与脂质体悬液轻轻混匀，静置20 min，将复合物均匀加入每孔中，培养4 h后更换含10%血清的培养基。

1.2.2CCK-8法检测细胞增殖 接种状态良好的细胞，调节细胞浓度至1×106个/孔(6孔板)；次日，分别转染空载体和IL-12过表达载体；转染 6 h 后，消化细胞重新接种到96孔板，6 000个/孔，培养不同时间后弃掉上清，加入10%CCK-8溶液100 μl，培养4 h；在450 nm处测定吸光度，并计算细胞活力。

1.2.3荧光定量PCR 参照Trizol说明书，提取细胞总RNA。将总RNA逆转录成cDNA并进行PCR反应。鼠IL-12上游引物为:GGTGTCTTAGCCAG-TCC，下游引物为CAGCTCCCTCTTCTTGT；IL-12Rβ2上游引物为CATGTTGCTGATGTGGGGGAAT，下游引物为ACTTATGCACTTGAGCGGGGGG。

1.2.4Transwell检测细胞迁移和侵袭 转染mIL-12-PsecTag过表达载体或对照空载体后，收集Hepa1-6细胞上清，将其加入Transwell下室。在观察肿瘤细胞的迁移能力时，上室加入未经处理的Hepa1-6细胞，共培养12 h；在观察异位过表达IL-12对淋巴细胞的募集作用实验中，上室加入脾细胞，共培养12 h，观察脾细胞的募集数量。

1.2.5Western blot检测STAT1活化 按照上述方法转染空载体和IL-12过表达载体，提取总蛋白；按照常规实验步骤完成SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭；将pSTAT-1和STAT1抗体按照1∶1 000孵育过夜；次日洗涤3次；二抗(1∶5 000)孵育1 h；洗涤3次 后进行显影及结果分析。

1.2.6小鼠肝脏单个核细胞分离 处死小鼠，剥离肝脏组织，离心(50 g,1 min)去除肝实质细胞，将上层液转移至新的50 ml离心管中；两次离心(400 g,6 min)后弃掉上清，底层细胞沉淀用40% Percoll溶液重悬，离心；加入红细胞裂解液，4℃裂解10 min；加1×PBS离心，悬起底层细胞，于4℃放置备用。

1.2.7FACS检测细胞中蛋白水平 每个流式管中加入20 μl大鼠血清进行封闭；加入适量不同抗体，并设置单标对照、同型对照，4℃放置1 h。离心洗涤两次 (400 g,6 min)；弃掉上清，每管加入200 μl PBS将底层细胞悬起，于流式仪上进行检测。对于胞内细胞因子检测，经固定、穿膜后，标记IFN-γ、TNF-α抗体，孵育2 h后，洗涤2次，流式细胞仪进行检测。

1.2.8荷瘤小鼠体内实验 选取6周龄的雄性C57BL/6小鼠，每只小鼠皮下注射2×106个Hepa1-6细胞。荷瘤1周后，瘤内注射PsecTag-mIL-12载体，每3天注射1次，每次15 μg，共计4次。3周后，处死小鼠，取肿瘤组织并称重；FACS检测瘤内淋巴细胞活化水平。

1.3统计学处理 数据应用SPSS13.0统计软件进行分析，两组数据间比较采用配对t检验。P<0.05认为差异有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。

位于一六多金属矿田南部、天门坳—牛公锥西主干断裂中段西侧、梅子冲银铅锌矿床南约4km处(图1)。赤老顶锑矿历史悠久，于清末始被发现和开采，矿体主要呈似层状、透镜状赋存于天子岭组内的硅化层或硅化断裂破碎带中，主矿体赋矿标高为409～134m，目前最深开采标高至+170m左右。断裂发育，具有近SN、NNE、NNW、NW、近EW及NE向等多组断裂，其中近SN向、NNE向、NNW向组与矿化关系较密切。围岩蚀变主要为硅化、方解石化。区内未见岩体出露。

2 结果

2.1mIL-12-PsecTag载体在肝癌细胞中有效表达IL-12 我们利用Lipo2000脂质体将mIL-12-PsecTag过表达载体转入小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞，进一步检测IL-12基因和蛋白水平。如图1A所示，与PsecTag空载体组相比，PsecTag-mIL-12组IL-12的mRNA水平显著升高。进一步用ELISA试剂盒对细胞上清中IL-12含量进行检测也观察到同样的结果(图1B)。以上结果证实，PsecTag-mIL-12载体可以在小鼠肝癌细胞中有效表达。

图1 mIL-12-PsecTag载体在肝癌细胞中有效表达IL-12Fig.1 Ectopic expression of IL-12 by Hepa1-6 cells transfected with mIL-12-PsecTag vectorNote:**.P<0.01.

2.2异位过表达IL-12能抑制Hepa1-6细胞增殖和迁移 为了证明异位过表达IL-12能够通过自分泌形式影响肝癌细胞，我们首先对Hepa1-6细胞IL-12受体进行了检测。如图2A所示，Hepa1-6细胞表达较高水平IL-12Rβ2，且mIL-12过表达能够显著提高其表达水平。然后，我们观察异位过表达IL-12对肝癌细胞恶性特征的直接影响。如图2B结果所示，转染PsecTag-mIL-12能够抑制Hepa1-6细胞增殖。接下来，利用Transwell的方法检测PsecTag-mIL-12载体对Hepa1-6细胞迁移和侵袭的影响。结果发现，与空载体组相比，过表达IL-12组Hepa1-6细胞迁移能力明显下降，且侵袭数量显著降低(图2C、D)。以上结果说明，异位过表达IL-12能够显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程。

图2 异位过表达IL-12能抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭Fig.2 Ectopic expression of IL-12 could inhibit prolifera-tion,migration and invasion of Hepa1-6 cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3异位过表达IL-12能抑制肝癌细胞负调分子的表达 肿瘤细胞能够通过多种方式来逃避免疫系统的攻击，而免疫抑制通路在肿瘤微环境中发挥了重要作用[1]。因此，我们对肝癌细胞免疫负调细胞因子TGF-β和免疫检查点分子PD-L1的表达水平进行了检测。如图3A所示，与空载体组相比，Hepa1-6细胞过表达PsecTag-mIL-12后，其上清中TGF-β含量显著降低。流式细胞术结果发现，过表达IL-12后Hepa1-6细胞表面PD-L1的表达水平明显下调(图3B)。以上结果提示，过表达IL-12能显著抑制肝癌细胞免疫负调分子的表达。

图3 异位过表达IL-12能抑制肝癌细胞负调分子的表达Fig.3 Ectopic expression of IL-12 could decrease expression of inhibitory molecules in HCCNote:*.P<0.05.

2.4肝癌细胞过表达IL-12能促进淋巴细胞的募集 我们进一步观察Hepa1-6细胞异位过表达IL-12对脾淋巴细胞的募集作用。Transwell实验结果显示，与空载体组相比，过表达PsecTag-mIL-12的Hepa1-6细胞上清所募集的脾细胞数量显著增加(图4A、B)。这一结果提示，异位过表达IL-12在促进淋巴细胞募集的同时，有可能对淋巴细胞发挥调节作用。

图4 肝癌细胞异位过表达IL-12能促进淋巴细胞的募集Fig.4 Ectopic expression of IL-12 in HCC could promote recruitment of lymphocytes in vitroNote:*.P<0.05.

2.5过表达IL-12能促进CD8+T细胞活化 为了进一步分析PsecTag-mIL-12载体转染肝癌细胞对所招募的免疫细胞亚群的影响，我们利用不同处理组的Hepa1-6细胞上清孵育脾细胞，然后利用流式细胞术的方法分析不同淋巴细胞亚群活化状态。结果显示，与空载体组相比，IL-12过表达组肝癌细胞上清能显著提高CD8+T细胞CD69的表达水平(图5A)，并且CD8+T细胞中IFN-γ和TNF-α分泌亦有显著升高(图5B、C)。我们进一步利用Western blot方法检测上述小鼠脾单个核细胞中STAT1的活化水平，结果发现，与空载体组相比，IL-12过表达组肝癌细胞上清处理的脾细胞中磷酸化STAT1水平显著增加(图5D)。以上结果表明，过表达IL-12能够激活STAT1信号通路并诱导CD8+T细胞活化。

图5 肝癌细胞异位过表达IL-12能激活STAT1信号通路促进CD8+T细胞活化Fig.5 Ectopic expression of IL-12 in HCC could IL-12 could activate T cells via STAT1 signalNote:*.P<0.05.

2.6IL-12载体能够激发荷瘤小鼠体内抗肿瘤免疫应答 最后，我们建立移植肿瘤模型，通过瘤内注射IL-12载体的方式观察抗肿瘤作用。结果显示，与空载体组相比，PsecTag-mIL-12治疗组肿瘤体积明显减小，肿瘤生长速度显著降低(图6A、B)。进一步分析肿瘤浸润淋巴细胞的活化水平，如图6C所示，PsecTag-mIL-12治疗组瘤内CD8+T细胞中CD69表达水平显著上调，且CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的量明显增加。我们还观察到，PsecTag-mIL-12治疗后，肿瘤内NK细胞CD69表达水平也发生显著升高(图6D)。以上结果说明，瘤内注射IL-12表达载体能够活化微环境中免疫细胞，从而发挥抗肿瘤作用。

图6 瘤内注射IL-12能抑制小鼠体内肿瘤生长并有效活化免疫细胞Fig.6 Intratumoral injection of IL-12 could inhibit tumor growth and activate immune cells in mice bearing Hepa1-6 cells Note:*.P<0.05.

3 讨论

改善肝癌微环境免疫抑制状态对于提高抗肿瘤效果具有重要的作用，其中增加抗肿瘤免疫应答的细胞因子是促进抗肿瘤免疫应答的策略之一。基于IL-12在诱导抗肿瘤免疫应答中发挥非常重要的作用[2]，并考虑到系统应用IL-12的副作用，本研究中我们构建了PsecTag-mIL-12过表达载体，拟通过肿瘤细胞内过表达的途径激活免疫系统，研究其抗肝癌的作用。我们发现，由于肝癌细胞表达IL-12受体，过表达的IL-12可以通过自分泌的形式与肝癌细胞表面受体结合，进而激活胞内信号通路，最终影响细胞增殖和迁移(图1和图2)。也有研究利用电转IL-12载体的方式在乳腺癌、黑色素瘤中进行治疗，同样也观察到显著的抗肿瘤效果[9,10]。

TGF-β不仅能够调节肿瘤细胞生长和分化，还能够通过多种途径帮助癌细胞逃避免疫系统的攻击[11,12]。我们观察到，肝癌细胞异位过表达IL-12能够降低TGF-β的表达(图3A)。此外，通过瘤内注射腺病毒IL-12载体在乳腺癌模型中也观察到类似的现象，且TGF-α介导的Treg细胞分化亦受到显著抑制[13]。在进一步实验中，我们将在肝癌模型中观察过表达IL-12对Treg细胞分化及功能的影响。

肿瘤微环境中高表达的PD-L1与肿瘤的免疫耐受密切相关，其通过与PD-1结合来抑制T细胞的功能，导致抗肿瘤免疫应答受到严重影响[14,15]。我们发现，异位过表达IL-12能够下调肝癌细胞表面PD-L1的表达(图3B)，这与在黑色素瘤、乳腺癌模型中瘤内注射IL-12载体观察到的现象是一致的[9,10,13]。以上结果提示我们，IL-12基因治疗能够解除肿瘤微环境中癌细胞对免疫细胞的抑制作用，促进抗肿瘤免疫应答。值得注意的是，随着PD-1、PD-L1阻断疗法的兴起，PD-1/PD-L1联合IL-12治疗方案在针对乳腺癌临床前试验中也取得了积极的治疗效果[16-18]。

此外，肿瘤细胞还能通过降低淋巴细胞浸润能力来逃逸免疫杀伤作用[15,19]。我们观察到，肝癌细胞异位过表达IL-12能够促进脾淋巴细胞的募集作用。这可能与IL-12高表达调控肝癌细胞趋化因子谱有关。有报道称乳腺癌模型中瘤内注射IL-12能够诱导CLL2、CCL3和CCL4的表达[20]，但是在肝癌模型中发挥关键作用的趋化因子尚待进一步寻找。另外，肝癌细胞异位表达IL-12能够促进免疫细胞中STAT1信号通路的活化，促进IFN-γ和TNF-α等的表达，并且在动物实验中也观察到类似的结果。以上结果表明，IL-12在肿瘤微环境中局部应用能够有效增加抗肿瘤免疫应答。

以上研究提示，局部使用IL-12能够更好地发挥抗肿瘤作用。一方面，IL-12以自分泌方式直接影响肿瘤特性；同时，IL-12在肿瘤局部有效表达，以旁分泌的形式活化微环境中免疫细胞，改善肿瘤免疫微环境。这些实验数据为IL-12基因治疗研究奠定了重要基础。随着免疫学、分子生物学等技术的不断发展，IL-12基因治疗或与其他治疗方法的联合应用将为临床肿瘤治疗提供新的途径。