潘光敏，申婷婷，陈宁，季万胜，高志星，代洪生，王津迪

（1.潍坊医学院 临床医学院，山东 潍坊 261053；2.潍坊医学院附属医院消化内科，山东 潍坊 261031）

胃癌是我国常见的高发病率和高死亡率的恶性肿瘤之一，且在消化道恶性肿瘤中居首位[1]。胃癌高死亡率一个很重要的原因是早期发现的生物标志物很少，早期诊断率低。低氧是恶性肿瘤生长的微环境特征之一。Δ133p53和p53β是p53选择性表达的2种常见异构体，两者在胃癌的发生、发展中起重要作用[2]。目前，有关p53异构体在低氧环境中的报道较少。本实验利用二氯化钴CoCl2模拟肿瘤低氧微环境[3]，观察低氧对胃癌细胞生长、迁移的影响，以及p53异构体表达变化。探讨p53异构体在缺氧诱导的胃癌细胞侵袭和转移过程中的作用及分子机制，为筛选胃癌精细治疗的靶分子，以及为临床早期诊断和治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胃癌细胞株SGC7901由第四军医大学馈赠，二氧化钴CoCl2（天津市光复精细化工研究所），CCK-8（上海翊圣生物科技有限公司），RPMI 1640培养液（美国Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶及青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司），Trizol试剂（北京康为世纪生物科技有限公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）试剂盒（日本东洋纺株式会社），巢式逆转录聚合酶链反应（nested reverse transcription-polymerase chain reaction, nRTPCR）扩增试剂（Pre-mix Taq）（北京康为世纪生物科技有限公司），琼脂糖（上海YIto企业有限公司），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人胃癌细胞培养于RPMI 1640完全培养基（含10%胎牛血清，100 u/ml青链霉素）中，置于5%二氧化碳CO2、37℃饱和湿度培养箱中。每48 h更换1次新鲜培养基，并在显微镜下观察细胞生长状况。48～72 h后用0.25%胰蛋白酶消化传代细胞1次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 CCK-8法检测不同浓度的CoCl2处理后胃癌细胞的细胞活力取对数生长期的细胞，接种到96孔板中（100μl/孔，密度约为5×104个/ml）。以“十”字水平轻摇培养板，使细胞平铺其中，并注明接种时间、细胞名称等。培养箱中培养24 h后弃去旧培养液，加入同体积含以下不同药物浓度的完全培养液。空白组：不含细胞和药物的培养液。对照组：含细胞和不含药物的培养液。实验组：①25μmol/L CoCl2组；②50μmol/L CoCl2组；③100μmol/L CoCl2组。每组设3个复孔，在培养箱中培养24 h后弃去培养液加入100μl体积分数为10% CCK-8的新鲜完全培养液（避光操作），培养箱孵育2 h，用酶标仪（波长450 nm）测各孔吸光度值。取每组平均值计算细胞活力，细胞活力 =（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。实验重复3次。

1.2.3 qRT-PCR检测胃癌细胞缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor 1 α, HIF-1α）mRNA的表达取对数生长期细胞，均匀接种到6孔板中（密度约2×104～3×104个/ml）。过夜细胞贴壁后，每孔加入含CoCl2的培养基2 ml（浓度分别为25、50及100μmol/L）。培养24 h后按Trizol试剂盒说明书步骤提取总RNA。用逆转录试剂盒合成cDNA。β-actin为内参照，反应体系为20μl，PCR反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。用PRISM 7500 qRT-PCR仪（美国ABI公司）对PCR产物进行实时定量分析。引物序列及片段长度见表1。

表1 PCR扩增引物序列

1.2.4 nRT-PCR检测p53β、Δ133p53α、Δ133p53β及Δ133p53γ mRNA的表达同1.2.3方法干预细胞提取总RNA进一步合成cDNA，β-actin为内参照，反应体系为25μl，PCR反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，72℃继续延伸2 min进行PCR第1次扩增。扩增完后从上述反应产物中取出2μl，再次加入PCR管中重新配成25μl的反应体系。按照以下反应条件进行PCR第2次扩增：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃继续延伸2 min，第2次所得产物即为最终产物。配置2%琼脂糖凝胶100 V电压电泳25 min，用凝胶成像分析系统观察电泳结果并拍照。引物序列及片段长度见表1。

1.2.5 划痕愈合实验检测胃癌细胞的迁移能力实验前将6孔板、直尺及枪头照射紫外线30 min，6孔板背面用直尺比着均匀地划横线，每孔穿过≥5条线。取对数生长期的细胞，接种到6孔板中（每孔约为2.1×105个细胞）。过夜细胞贴壁后，用白枪头比着直尺自上而下划痕，枪头要垂直，不能倾斜。磷酸盐缓冲液洗涤2次，去除划下的细胞，加入含1%血清的完全培养基及药物。实验分组为对照组和100μmol/L CoCl2组。置于5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中，按0、6、12及24 h取样拍照。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CoCl2对人胃癌细胞活力的影响

CCK-8法结果显示25、50及100μmol/L CoCl2作用人胃癌细胞后，其细胞活力分别为（104.28±4.48）%、（111.59±6.99）% 及（130.33±8.58）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=11.404，P=0.009），细胞活力在100μmol/L内随浓度升高而增强。说明CoCl2模拟的低氧微环境中细胞生长并未受到抑制，一定程度的低氧条件可促进胃癌细胞生长。

2.2 CoCl2对人胃癌细胞HIF-1α、p53β、Δ133p53α、Δ133p53β及Δ133p53γ mRNA表达的影响

在人胃癌细胞中，不同浓度CoCl2对人胃癌细胞HIF-1α、p53β、Δ133p53α 及 Δ133p53β mRNA的相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较，25μmol/L和50μmol/L CoCl2组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；100μmol/L CoCl2组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），100μmol/L CoCl2组 HIF-1α、Δ133p53α及Δ133p53β的表达量高于对照组，而p53β的表达量低于对照组。对照组与实验组未检测到Δ133p53γ的表达。见表2和图1、2。

2.3 CoCl2对人胃癌细胞迁移能力的影响

划痕愈合实验显示，用100μmol/L CoCL2处理人胃癌细胞24 h后，其向空隙处迁移的距离大于对照组细胞。结果表明，缺氧后胃癌细胞的迁移速度加快。见图3。

表2 各组人胃癌细胞中HIF-1α、Δ133p53α、Δ133p53β及p53β mRNA相对表达量比较 （n =3，±s）

表2 各组人胃癌细胞中HIF-1α、Δ133p53α、Δ133p53β及p53β mRNA相对表达量比较 （n =3，±s）

p53β mRNA对照组 1.00±0.00 1.47±0.03 1.27±0.05 1.33±0.02 25μmol/L CoCl2组 1.19±0.16 1.56±0.03 1.39±0.04 1.27±0.04 50μmol/L CoCl2组 1.30±0.20 1.55±0.04 1.38±0.11 1.47±0.04 100μmol/L CoCl2组 1.91±0.29 1.61±0.04 1.50±0.04 1.25±0.03 F值 12.326 6.831 6.589 26.025 P值 0.002 0.013 0.015 0.000组别 HIF-1α mRNA Δ133p53α mRNA Δ133p53β mRNA

图1 各组人胃癌细胞中Δ133p53α、Δ133p53β、Δ133p53γ及p53β mRNA的琼脂糖凝胶电泳图

图2 各组人胃癌细胞中HIF-1α、Δ133p53α、Δ133p53β及p53β mRNA相对表达量比较 （±s）

图3 不同时间点划痕愈合实验结果 （×40）

3 讨论

低氧是恶性肿瘤生长的微环境特征之一，肿瘤细胞适应缺氧环境的一个重要变化就是HIF-1α的激活。ROHWER等[4]发现，约90%的晚期胃癌标本表达HIF-1α。GRIFFITHS等[5]进一步证实，在正常胃黏膜活检组织中未检测到HIF-1α的表达。另有研究表明，HIF-1α在具有侵袭性特征的胃癌中高表达，在复发胃癌中尤为明显[6]。胃癌中HIF-1α可通过上调其下游基因血管内皮细胞生长因子而诱导胃癌血管生成，并参与肿瘤侵袭和远处转移[7]。而干扰HIF-1α后，胃癌细胞的增殖水平降低[8]，体外敲除HIF-1α可减少胃癌细胞迁移、侵袭及黏附[4]。综上可推测，HIF-1α在胃癌细胞迁移、侵袭中发挥重要作用，可能在疾病的晚期更为明显。

传统上认为，抑癌基因TP53可预防肿瘤的形成和转移，但其突变状态与肿瘤发生密切相关。p53可通过双重启动选择性表达12种剪接异构体，如p53、p53β、p53γ、Δ40p53、Δ40p53β、Δ40p53γ、Δ133p53、Δ133p53β、Δ133p53γ、Δ160p53、Δ160p53β及Δ160p53γ[9]。研究证实，p53异构体在胃癌[2]、结肠癌[10-11]、胆管癌[12]、乳腺癌[13]及神经母细胞瘤[14]等有异型表达。

Δ133p53和p53β是p53选择性表达的2种常见异构体。WEI等[15]研究发现，幽门螺旋杆菌感染可利用其Ⅳ型分泌系统通过CAG致病岛活化激活蛋白1，进而特异性地激活TP53P2启动子，引起Δ133p53的表达，使幽门螺旋杆菌相关慢性胃炎向胃癌进展。结肠癌的研究发现，结肠癌组织中Δ133p53表达升高，p53β表达降低。p53β与全长p53协同促进细胞衰老，而Δ133p53可延长细胞复制寿命[11]，这与在胃癌化疗中的研究结果一致[2]。该实验的前期研究发现，在胃癌中Δ133p53与癌基因鼠双微体基因2（mousedouble minute 2, MDM2）呈正相关，而与抑癌基因磷酸酶张力蛋白同源基因呈负相关[16]，促使具有E3连接酶活性的MDM2通过蛋白酶体机制促进p53泛素化进而降解，使p53功能失活。因此，Δ133p53异构体可发挥促癌作用，p53β协同p53发挥抑癌作用。进一步了解胃癌p53的状态非常必要。

本实验研究发现，在100μmol/L CoCl2浓度内，随着缺氧程度的增加，人胃癌细胞活力逐渐增强。 且 100μmol/L CoCl2组 HIF-1α、Δ133p53α及Δ133p53β mRNA相对表达量高于对照组，而p53β mRNA低于对照组。对照组与实验组未检测到Δ133p53γ的表达。根据以上结果推测，缺氧所诱导的HIF-1α可能通过某一途径激活具有促癌作用的Δ133p53α、Δ133p53β，而不是Δ133p53γ的表达；同时抑制具有抑癌作用的p53β的表达来削弱细胞中p53的促凋亡作用，从而促进胃癌细胞的生长与迁移。

综上所述，胃癌进展过程中出现的低氧微环境可进一步促进胃癌细胞生长、迁移。p53异构体中的Δ133p53α、Δ133p53β 及p53β有望成为胃癌基因诊断的可能指标。通过一定的技术手段抑制Δ133p53α、Δ133p53β的表达或激发p53β的表达，可为胃癌药理研究提供新的思路。然而目前尚不清楚HIF-1α是如何上调Δ133p53α、Δ133p53β，以及抑制p53β的表达，还待进一步研究。