王霖 王晓燕 李才信

【摘要】 目的 探讨利福平耐药结核杆菌实时荧光定量扩增检测技术（GeneXpert）、结核感染T细胞检测（QFT.TB）和结核杆菌快速培养、鉴定及药敏培养（BACTEC MGIT 960）快速联合检测在肺结核诊断中的应用研究。方法 选取200例疑似肺结核患者作为研究对象， 均行GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960快速聯合检测。比较GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960单纯检测与联合检测结核病的结果;GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960单纯检测与联合检测肺结核病效能。结果 QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960对肺结核检测的阳性率分别为73.5%、81.5%、81.5%， 高于GeneXpert、BACTEC MGIT 960单独检测及二者联合检测的44.0%、39.0%、44.0%， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。QFT.TB、QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960诊断肺结核的AUC比较差异均无统计学意义（P>0.05）， 但QFT.TB、QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960诊断肺结核的AUC均大于GeneXpert、BACTEC MGIT 960、GeneXpert+BACTEC MGIT 960的AUC， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论 肺结核诊断中， GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960三者快速联合检测的结果准确、可靠， 价值更高， 值得在临床上推广与应用。

【关键词】 利福平耐药结核杆菌实时荧光定量扩增检测技术;结核感染T细胞检测;鉴定及药敏培养;快速联合检测;肺结核

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.22.008

【Abstract】 Objective   To study the application of real-time fluorescence quantitative for detection of rifampicin-resistant （GeneXpert）， T cells detection for tuberculosis infection （QFT.TB） and rapid culture， identification and drug sensitivity culture （BACTEC MGIT 960） rapid combined detection in the diagnosis of tuberculosis. Methods   A total of 200 suspected pulmonary tuberculosis patients were selected as the study subjects， and all of them were detected by GeneXpert， QFT.TB and BACTEC MGIT 960. The results and efficacy of simple detection and joint detection of GeneXpert， QFT.TB and BACTEC MGIT 960 for tuberculosis were compared. Results   The positive rates of QFT.TB， QFT.TB+BACTEC MGIT 960， GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960 for tuberculosis detection were 73.5%， 81.5%， and 81.5%， respectively， which were higher than 44.0%， 39.0% and 44.0% by simple and combined detection of GeneXpert and BACTEC MGIT 960， and their difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in AUC between QFT.TB， QFT.TB+BACTEC MGIT 960， GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960 for diagnosis of tuberculosis （P>0.05）. However， the AUC of the diagnosed tuberculosis of QFT.TB， QFT.TB+BACTEC MGIT 960， GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960 was greater than the AUC of GeneXpert， BACTEC MGIT 960， GeneXpert+BACTEC MGIT 960， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion   In the diagnosis of tuberculosis， the results of the rapid combined detection of GeneXpert， QFT.TB and BACTEC MGIT 960 are accurate， reliable and of higher value. This method is worthy of clinical promotion and application.

【Key words】 Real-time fluorescence quantitative for detection of rifampicin-resistant; T cells detection for tuberculosis infection; Identification and drug susceptibility culture; Rapid combined detection; Pulmonary tuberculosis

近年來， 肺结核的发病人数越来越多， 各种诊断方法也不断涌现， 新出现的免疫学技术、分子生物学技术为临床上快速诊断肺结核以及结核分枝杆菌（MTB）耐药性奠定了基础[1]。GeneXpert是临床上新型的诊断MTB与耐药性的分子诊断技术（美国Cepheid公司研发）， 该检测方法在临床上引起了高度的重视[2]。WHO推荐 Xpert应当用于多重抗药性结核病（MDR-TB）和人类免疫缺陷病毒（HIV）高发病率地区的快速筛查， Xpert可用于儿童结核病的早期诊断， 推荐Xpert替代涂片、培养等技术用于肺外结核的快速诊断。QFT.TB是临床上应用MTB特异性抗原来刺激外周血单个核细胞分泌γ-干扰素（IFN-γ）含量的一种检测技术， 它主要是为了判断MTB是否发生了感染[3]。BACTEC MGIT 960主要应用了荧光法原理， 通过感应培养管内氧浓度的消耗情况来对MTB的生长状况进行反映的技术， 它可以实施24 h动态监测[4]。本院在肺结核诊断中， 应用GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960快速联合检测， 检测阳性率比单纯使用一种方法检测或者是两种检测方法联合的诊断结果准确可靠， 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2017年10月～2019年3月本院收治的疑似肺结核患者200例作为研究对象。纳入标准：患者均知晓同意此次研究。排除标准：①不符合肺结核诊断标准的患者;②不同意本次研究的患者;③存在其他重大疾病的患者;④精神异常的患者。200例患者中， 男145例， 女55例;年龄18～80岁， 平均年龄（56.5±12.9）岁。本次研究通过了本院伦理委员会审批。

1. 2 方法

1. 2. 1 标本收集

1. 2. 1. 1 痰标本收集 患者在收集标本前用清水漱口2次后， 将无菌痰瓶打开深吸气用力从肺部将痰液咳出， 将痰液收集到痰瓶中， 将瓶盖拧紧后保存在2～8℃环境下及时送到检验科。

1. 2. 1. 2 穿刺液、支气管灌洗液标本 严格按照临床无菌操作规程来对标本进行收集[5]。

1. 2. 2 GeneXpert检测

1. 2. 2. 1 收集1 ml痰液样本至50 ml刻度离心管中， 加入痰液样本2倍体积的样本处理液， 将混合好的样本在20～30℃放下置10 min， 涡旋震荡至少10 s， 放置5 min。

1. 2. 2. 2 穿刺液、支刷物、支气管灌洗液等标本3000 r/min， 离心15 min去上清留沉淀， 加入2 ml样本处理液同痰标本处理方式进行。试剂盒经仪器识别检测后， 将处理后的样品2 ml由检测匣的加样孔缓慢加入。

1. 2. 2. 3 将其放置到检测模块仪器中自动进行检测， 2 h后系统会对利福平耐药检测结果、MTB检测结果进行自动判读[6]。利福平检测结果主要为敏感、耐药;MTB检测结核菌结果为阳性或阴性。

1. 2. 3 QFT.TB检测

1. 2. 3. 1 标本收集：用肝素锂抗凝采血管采集5 ml静脉血， 样本采集后4 h内送检。

1. 2. 3. 2 把处理后的样本培养管放入培养箱内孵育16～24 h。

1. 2. 3. 3 第2天孵育结束后， 从培养箱内拿出培养管， 3000 r/min， 离心15 min， 离心好以后备用。

1. 2. 3. 4 进行试剂的配置、标准品的配置、酶结合物的配置、洗涤液配置。

1. 2. 3. 5 按操作步骤进行处理后， 洗板、显色， 加终止液， 比色。

1. 2. 3. 6 结果报告：结果判定：①阴性：阳性管>0.5 IU/ml， 抗原管-阴性管<0.35 IU/ml;②阳性：抗原管-阴性管≥0.35 IU/ml;③不定：阳性管<0.35 IU/ml， 抗原管-阴性管<0.35 IU/ml或阴性管≥8.0 IU/ml[7]。

1. 2. 4 BACTEC MGIT 960检测

1. 2. 4. 1 痰标本直接留取1～2 ml， 其他标本取5～10 ml于刻度离心管以4600 r/min离心15 min后留沉淀物于刻度离心管内， 并在管壁上标注编号和日期。

1. 2. 4. 2 加入4% NaOH 5～7 ml并用竹签打磨至痰液完全液化（液化过程控制在15～20 min）， 平衡离心管后4600 r/min， 离心10 min。

1. 2. 4. 3 取出离心管后弃上清液， 加灭菌PBS缓冲液2～3 ml， 混匀后4600 r/min， 离心10 min。取出离心管后弃上清液， 加灭菌PBS 2 ml， 充分混匀。

1. 2. 4. 4 于培养管中加入0.8 ml营养添加剂/杂菌抑制剂混合物， 用加样器取0.5 ml处理后的标本液加入MGIT培养管内， 仪器自动培养报告结果。

1. 2. 4. 5 结果报告：MTB BACTEC MGIT 960检测阴性或阳性， 将标本取出经过抗酸染色后为阳性的为MTB阳性， 将阳性标本再经过噻吩-2-羧酸肼、耐热触酶试验、8℃生长试验、硝基苯甲酸生长试验判断为MTB阳性或者是阴性[8]。药敏结果判断：当生长对照管为阳性时仪器开始对药敏管结果进行判读， 对连续2 d的结果进行判读。当药敏管在生长对照管出现阳性后2 d仍然无生长则判断为敏感， 有细菌生长则判断为耐药。

1. 3 观察指标 ①比较GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960单纯检测与联合检测结果。②比较GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960单纯检测与联合检测肺结核病效能。

1. 4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验， 多组比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。用Graphpad Prism5 软件绘制受试者工作特征（ROC）曲线， 评价单个检测方法的效能， 曲线下面积（AUC）比较采用Z检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960单纯检测与联合检测结果对比 QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960对肺结核检测的阳性率分别为73.5%、81.5%、81.5%， 高于GeneXpert、BACTEC MGIT 960单独检测及二者联合检测的44.0%、39.0%、44.0%， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960单纯检测与联合检测肺结核病效能对比 QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960诊断肺结核的AUC比较差异均无统计学意义（P>0.05）， 但QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960诊断肺结核的AUC均大于GeneXpert、BACTEC MGIT 960、GeneXpert+BACTEC MGIT 960的AUC， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

结核病是由MTB引起的慢性传染病。中国结核病防治形势非常严峻， 2014 年估算的发病例数为93万， 位居全球第三位， 是全球22个高负担国家之一[9]。

GeneXpert是临床上新型的诊断MTB与耐药性的分子诊断技术， 主要是以半巢式实时荧光PCR技术为基础对分子进行检测， 通过该检测方法在2 h内就可以检出利福平的耐药性、MTB， 由于利福平一般沒有单药耐药情况， 临床上常将利福平耐药作为诊断耐多药结核病的标准[10]。WHO关于Xpert推荐意见-2013（修订版）， Xpert应当用于MDR和HIV高发病率地区的快速筛查， Xpert可用于儿童结核病的早期诊断， 推荐Xpert替代涂片、培养等技术用于肺外结核的快速诊断。

QFT.TB主要是检测血液中特异的T淋巴细胞、IFN-γ的技术， 它的敏感度非常高， 不容易受到CD4+ T淋巴细胞数量的影响。应用该方法对结核病合并免疫缺陷患者进行检测的效果仍然较为准确。2016美国CDC指南推荐全血γ-干扰素释放试验（IGRA）的测定方法， 是其他国家人员进入美国境内的结核感染的筛查方法之一。

BACTEC MGIT 960是当前临床上进行药敏试验、MTB培养的主要方法， 但是对于肺结核、肺外结核患者来说常需要将以上3种方法联合进行检测， 肺结核患者检测结果阳性率高于非肺结核患者[11]。肺外结核患者、肺结核患者经过QFT.TB检测的阳性率高于GeneXpert、BACTEC MGIT 960检测方法。

GeneXpert可以对MTB的核酸、利福平的耐药性进行直接的检测， 它在诊断耐药结核病的期间发挥了关键性作用， 且该方法的操作步骤较为简单， 可以有效减少基因检测污染状况的发生。QFT.TB主要是检测MTB T细胞介导的IFN-γ反应（由CFP-10、ESAT-6、P4所引发）， 对于早期菌阴结核病患者与结核病患者来说， 应用该方法检测的价值较高。BACTEC MGIT 960可以对MTB进行快速培养的结果进行准确、快速的检测， 而单纯使用一种方法的效能并不能达到理想的状态， 而将其与GeneXpert、QFT.TB联合进行快速检测， 可以显著提高临床诊断效能。

常规对结核病辅助诊断的方法有痰涂片找抗酸杆菌、痰培养法、血清学方法等， 但这些方法的特异性和敏感性均较低。3种方法联合检测， 互相弥补不足， 从而减少肺结核病的误诊， 漏诊， 是一组值得推广的检测方法。特别是有更高的阴性预测值， 有利于排除肺结核病的诊断[12]。

本研究显示， QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960对肺结核检测的阳性率分别为73.5%、81.5%、81.5%， 高于GeneXpert、BACTEC MGIT 960单独检测及二者联合检测的44.0%、39.0%、44.0%， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960诊断肺结核的AUC比较差异均无统计学意义（P>0.05）， 但QFT.TB、 QFT.TB+BACTEC MGIT 960、GeneXpert+QFT.TB+BACTEC MGIT 960诊断肺结核的AUC均大于GeneXpert、BACTEC MGIT 960、GeneXpert+BACTEC MGIT 960的AUC， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。

综上所述， 在肺结核诊断中， 应用GeneXpert、QFT.TB、BACTEC MGIT 960快速联合检测， 检测阳性率及效能最高， 临床利用价值很大， 为诊断肺结核患者提供了新的方法与途径， 值得在临床上多加广泛推广与应用。