崔丹丹 武昕

外阴疾病中RhoA的表达及意义

崔丹丹 武昕

目的探讨外阴疾病中RhoA的表达情况,分析其与外阴疾病发生发展的关系。方法采用免疫组化方法检测RhoA在外阴硬化性苔藓及外阴鳞状细胞癌中的表达,并收集外阴鳞状细胞癌患者的临床病理资料进行分析。结果RhoA在外阴硬化性苔藓中的表达为(44.07±1.45),显著高于其在外阴正常皮肤中的表达(31.22±2.46)(P＜0.05)。在外阴鳞状细胞癌中的表达为(77.22±3.08),显著高于其在外阴硬化性苔藓与外阴正常皮肤中的表达(P＜0.05)。RhoA在Ⅰ～Ⅱ期外阴磷状细胞癌中表达为(71.83±4.31),Ⅲ～Ⅳ期为(82.05±1.32),比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；在不同病理分级中表达为：高分化(71.22±2.89),中低分化(75.05±2.78),比较差异无统计学意义(P＞0.05)；在有淋巴结转移中为(78.21±1.71),明显高于无淋巴结转移的(63.31±2.51)(P＜0.05)；RhoA的表达与年龄及细胞分化无关。结论RhoA的表达与外阴磷状细胞癌及外阴硬化性苔癣的发生、发展有关。

RhoA；外阴鳞状细胞癌；外阴硬化性苔藓；免疫组化

Rho家族蛋白是小G蛋白家族中的成员之一,其具有三磷酸鸟苷(GTP)酶活性,Rho家族蛋白在基因转录、细胞周期调控、膜泡运输中起重要作用。文献显示,RhoA在人类多种恶性肿瘤中异常表达,如食管癌、胃癌、宫颈癌等,并在其发生发展和侵袭转移中发挥重要作用［1-3］。

外阴硬化性苔癣(vulvar lichen sclerosus,VLS)是常见的外阴上皮非内瘤样病变,可发生于任何年龄,以40岁左右的妇女多见,是一种潜在的癌前病变。其中约有4%～7%患有外阴硬化性苔藓的妇女发展为外阴癌［4］。外阴鳞状上皮癌占外阴恶性肿瘤的80%以上,约60%左右患者合并有外阴硬化性苔藓［5］。目前两种疾病的病因及发病机制尚未完全弄清,并且外阴硬化性苔藓在什么情况下会进展为外阴磷状细胞癌尚不清楚。因此本研究运用免疫组化的方法探讨RhoA的表达与外阴硬化性苔癣和外阴磷状细胞癌发生、发展是否相关。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007～20012年中国医科大学附属第一医院病理教研室经手术切除或活检存档的蜡块；其中外阴磷状细胞癌60例,外阴硬化性苔藓30例,外阴正常皮肤20例。所有患者病理资料完整,术前均未行放化疗及物理治疗,标本均经2位资深病理医师镜下确认。收集外阴鳞状细胞癌患者的详细临床病理资料,年龄33～72岁,平均年龄(50.1±7.3)岁。根据国际妇产科联盟(FIGO)(2009年)临床分期：Ⅰ期16例,Ⅱ期30例,Ⅲ期10例,Ⅳ期4例；分化程度：高分化者36例,中分化者14例,低分化者10例。有淋巴结转移者16例,无淋巴结转移24例。

1.2 实验试剂 兔抗人RhoA多克隆抗体、即用型SABC试剂盒,二氨基联苯胺(DAB)显色液均购自北京博奥森生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化方法检测 石蜡切片进行常规脱蜡水化。并置于3%过氧化氢(H2O2)室温孵育20 min从而灭活内源性过氧化物酶,再进行抗原修复,滴加5%BSA封闭液,室温20 min,滴加适当一抗RhoA(1:200)于4℃冰箱过夜,再滴加相对应的二抗生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育30 min,滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液,并在室温下孵育20 min,随后进行DAB显色,最后苏木素复染封片。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照片。

1.3.2 结果判定 在光学显微镜下观察,以细胞浆或细胞膜出现黄色或棕黄色颗粒者则认定为阳性,运用BX60万能显微照相系统(OLYMPUS,日本)对切片进行图像采集,利用显微图像分析系统对采集的图像进行积分光密度值测定,每张切片分别选取5个不同视野,计算同一张切片的平均积分光密度值,则代表阳性染色细胞在该组织中的表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数± 标准差(±s)表示,采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoA在外阴正常皮肤组织、外阴硬化性苔藓及外阴磷状细胞癌中的表达 RhoA蛋白阳性表达于细胞浆及细胞膜,呈棕黄色颗粒。在外阴正常皮肤中阳性细胞分布于基底细胞层,表达阳性细胞的平均光密度值为(31.22±2.46)；在外阴硬化性苔癣中阳性细胞位于表皮中上层,在真皮细胞中不表达,表达阳性细胞的平均光密度值为(44.07±1.45),外阴正常皮肤与外阴硬化性苔癣表达阳性细胞的平均光密度值比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。RhoA在外阴鳞状细胞癌中表达阳性细胞分布在癌巢中,表达阳性细胞的平均光密度值为(77.22±3.08),显著高于其在外阴硬化性苔癣与外阴正常皮肤中的表达,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 RhoA的表达与外阴鳞状细胞癌临床病理特征的关系RhoA在Ⅰ～Ⅱ期外阴磷状细胞癌中表达为(71.83±4.31),Ⅲ～Ⅳ期为(82.05±1.32),比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；在不同病理分级中表达为：高分化(71.22±2.89),中低分化(75.05±2.78),比较差异无统计学意义(P＞0.05)；在有淋巴结转移中为(78.21±1.71),明显高于无淋巴结转移的(63.31±2.51),差异具有统计学意义(P＜0.05)；RhoA的表达与年龄无关(P＞0.05)。

3 讨论

Rho(ras homologous) 家族蛋白是Ras 超家族中小分子量G蛋白的成员之一,包括有RhoA、B、C、D和E等蛋白。RhoA全称为Ras同源类似物A,其基因全长约16 kb,定位于3p21.3。RhoA含有高度保守的二磷酸鸟苷(GDP)/GTP结合区和GTP酶活性区,当与GDP结合时处于非活性状态,而与GTP结合时则处于活性状态,此外还具有靶区和膜定位结构。同异三聚体G蛋白一样,通过无活性GDP状态和活性GTP状态方式的转换发挥其重要的分子开关作用。本研究结果证实RhoA在外阴硬化性苔藓中的表达显著高于外阴正常组织,提示RhoA参与外阴硬化性苔藓病变的发生,其可能通过调节细胞凋亡及细胞分裂等生物学行为参与外阴硬化性苔藓病变的发生,具体机制则有待进一步研究探讨。

本研究显示RhoA在外阴磷状细胞癌中的表达显著高于外阴正常皮肤,并且在有淋巴结转移及临床分期高的病例中高表达。据文献报道［6-8］,处于活性状态的RhoA可促进肿瘤的侵袭与转移,其机制可能为:①调控下游效应蛋白ROCK或mDia,调节细胞肌动蛋白微丝骨架的聚合、导致肌动蛋白微丝的重排,加强细胞迁移能力;②使细胞周期素D1(Cyclin D1)的表达上调、抑制p21WAF1和p27KIPl的表达,将细胞阻滞于G1和G2/M期,从而影响肿瘤细胞的增殖、生长;③使上皮型钙粘素(E-cadherin)表达下调,破坏肿瘤细胞间粘附;④调节基质金属蛋白酶-2(MMP2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)的活性从而促进细胞外基质降解;⑤调节血管内皮生长因子(VEGF)、环氧合 酶-2(COX-2)促进新生血管生成;基因转录激活激活蛋白-1(AP-1)、核因子κB(NF-κB)、血清反应因子(SRF)等核转录因子,这些核转录因子可使肿瘤相关基因发生转录。另外,RhoA在外阴磷状细胞癌中的表达显著高于外阴硬化性苔藓(P＜0.05)。这与其恶性转化的能力相关。RhoA具有癌基因的功能,它可引起胸腺细胞的锚定非依赖性生长并可导致胸腺细胞在裸鼠体内形成肿瘤,提示RhoA具有对胸腺细胞的恶性转化能力。RhoA还通过降低转录因子甲状腺转录因子 1(TTF 1)的活性介导了Ras对胸腺细胞的恶性转化,抑制RhoA的功能表达可逆转这一转化作用。

［1］张雷.食管癌中RhoA蛋白的表达及意义.海南医学院学报,2015,21(4):460-463.

［2］Su XJ,Tang ZF,Li Q,et al.Expression and significance of RhoA and NF-κB in human gastric carcinoma.Zhonghua zhong liu za zhi,2011,33(4):276-279.

［3］Liu X,Chen D,Liu G.Overexpression of RhoA promotes the proliferation and migration of cervical cancer cells.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2014,78(11):1895-1901.

［4］Hp VDN,Ia VDA,de Hullu JA.Review of squamous premalignant vulvar lesions.Critical Reviews in Oncology/hematology,2008,68(2):131-156.

［5］Rolfe KJ,Maclean AB,Crow JC,et al.TP53 mutations in vulval lichen sclerosus adjacent to squamous cell carcinoma of the vulva.British Journal of Cancer,2003,89(12):2249-2253.

［6］张丽华,王婧,武昕.Moesin和RhoA蛋白在外阴鳞癌中的表达及意义.中国妇幼保健,2015,30(3):414-416.

［7］张德宇,张士泰,欧阳玲.RhoA蛋白在外阴鳞癌组织中的表达及临床意义.中国医科大学学报,2012,41(10):937-940.

［8］崔丹丹.RhoA和RhoC蛋白在外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中表达及意义.中国医科大学,2011.

Expression and significance of RhoA in vulvar disease

CUI Dan-dan,WU Xin.Shenyang City Maternal and Infantile Hospital,Shenyang 110000,China

ObjectiveTo investigate expression of RhoA in vulvar disease,and to analyze its relationship with occurrence and development of vulvar disease.MethodsImmunohistochemistry method was applied to detected expression of RhoA in lichen sclerosus of vulva and vulvar squamous cell carcinoma.Clinical and pathological data of vulvar squamous cell carcinoma patients were collected for analysis.ResultsExpression of RhoA in lichen sclerosus of vulva was obviously higher as(44.07±1.45) than(31.22±2.46) in normal vulvar skin(P＜0.05).Expression of RhoA in vulvar squamous cell carcinoma was much higher as(77.22±3.08) than those in lichen sclerosus of vulva and normal vulvar skin(P＜0.05).Expression of RhoA was(71.83±4.31) in stage Ⅰ～Ⅱvulvar squamous cell carcinoma and(82.05±1.32) in stage Ⅲ～Ⅳ,and the difference had statistical significance(P＜0.05).Expression in different pathological classification was(71.22±2.89) in high differentiation and(75.05±2.78) in low differentiation.There was no statistically significant difference between high differentiation and low differentiation(P＞0.05).Expression in lymphatic metastasis was obviously higher as(78.21±1.71) than(63.31±2.51) in non-lymphatic metastasis(P＜0.05).Expression of RhoA was not ralted with age and cell differentiation.ConclusionExpression of RhoA is related with occurrence and development of vulvar squamous cell carcinoma and lichen sclerosus of vulva.

RhoA; Vulvar squamous cell carcinoma; Lichen sclerosus of vulva; Immunohistochemistry

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.01.027

2016-12-09］

110000 沈阳市妇婴医院(崔丹丹)；中国医科大学附属第一医院妇科(武昕)

武昕