汤佩佩，蔺志杰，潘志明，焦新安

沙门菌T3SS相关效应蛋白作用机制的研究进展

汤佩佩，蔺志杰，潘志明，焦新安

沙门菌是人兽共患病原菌，能感染宿主并导致严重的并发症和死亡。沙门菌的致病性主要是由沙门菌SPI-1和SPI-2编码的T3SS的效应蛋白相互作用的结果。本文主要对T3SS相关效应蛋白在沙门菌感染的不同阶段发挥的功能进行综述，以期为进一步了解沙门菌致病机理提供参考。

沙门菌；T3SS效应蛋白；功能

沙门菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性致病菌，能引起食物中毒、肠胃炎、伤寒和败血症等[1]。鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)是常见食源性病原菌之一，其在感染动物和人的症状颇为相似，感染鼠伤寒沙门菌临床上多表现为胃肠炎症状。尽管沙门菌引起的腹泻及炎症的发病机理已被广泛研究，但是沙门菌如何长期调节宿主细胞的机制尚且不清楚。细菌的致病性是由毒力因子所决定的，不同的毒力基因组成的基因簇即为毒力岛(pathogenicity islands)。沙门菌含有5个毒力岛(SPI1-5)，且至少包括60个毒力基因[2]。细菌的致病性与细菌的Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion / translocation systems，T3SS)有关。T3SS是一个由膜内/外蛋白组成的多组份跨膜通道，其结构类似“注射器”。其主要功能是负责效应蛋白的分泌和转运，通过改变宿主细胞的生理机制来促进细菌的侵入与存活。鼠伤寒沙门菌编码两个毒力岛，即SPI-1和SPI-2。由SPI-1和SPI-2编码的T3SS是沙门菌致病性重要的毒力因子，不同T3SS效应蛋白在沙门菌致病的各个阶段发挥不同的功能。因此本文主要选择以鼠伤寒沙门菌为模型，对沙门菌相关T3SS效应蛋白在感染的不同阶段中发挥的功能进行了阐述，以期更好地了解沙门菌的致病机理，为沙门菌的防御和控制研究提供更多的信息。

1 依赖SPI-1T3SS的侵袭过程

与大多数革兰氏阴性菌一样，鼠伤寒沙门菌不仅具有内化作用(internation)还具有侵入非吞噬细胞的能力，即沙门菌介导的内吞作用。这种内化和内吞作用都需要许多效应蛋白的参与，如Ssp蛋白家族的SipABCD、SopB、SopE、SopE2等。这些效应蛋白能够介导肌动蛋白重塑，导致细胞膜内陷以及吞噬体膜与目标颗粒结合。一旦细菌进入细胞，便伴随着宿主细胞信号转导的变化，进而影响一系列重要的生理生化进程，如膜的转运、抗原的递呈、细胞因子的产生、细胞分裂、凋亡以及微生物的清除等。这种沙门菌与宿主之间复杂的相互作用，将决定沙门菌在宿主内的命运。

沙门菌SipA蛋白是由SPI-1 T3SS编码的，是一种双重功能的蛋白，具有诱导细胞骨架重排、参与细菌侵袭、进入细胞的功能。其C端能结合和绑定F-肌动蛋白且可以加强T-丝束蛋白的活性，导致膜内陷，促进细菌进入宿主细胞。而其N端含有激活上皮细胞信号转导通路的功能结构域，这个通路会促进中性粒细胞的跨膜迁移[3]。

SopB是一种依赖T3SS分子伴侣的效应蛋白，具有磷酸肌醇磷酸酶活性，可以水解磷酸肌醇和肌醇磷酸盐，引起宿主细胞产生不同的生理效应。沙门菌分泌SopB蛋白首先作用于细胞膜，激活小分子GTPase，如Cdc42，参与肌动蛋白的重塑。研究表明，SopB与Cdc42通过模拟真核生物的CRIB(Cdc42 and Rac-interactive binding)样的基序特异性的结合[4]，从而进一步活化肌动蛋白核化调节因子-Arp2/3(Actin related protein2/3，ArP2/3)[5]，促进肌动蛋白的多聚化，诱导沙门菌膜骨架重排，促进细菌进入宿主细胞。

与SipA/C、SopB不同的是，SopE和SopE2不具有绑定肌动蛋白的功能，但它们具有鸟氨酸交换因子(Guanine nucleotide exchange factor，GEF)的功能。这个家族的效应蛋白都含有一个保守的W-XXX-E(Trp-X-X-X-Glu)序列模体[6]，可直接激活小分子GTPAase，如Rac1和Cdc42。作为一种分子开关，SopE和SopE2的催化区域是一个可适当弯曲的环状结构，利用氨基酸残基和酸性侧链，将GTPase与GDP结合的状态置换成与GTP结合状态并激活宿主的小分子GTPase[7]，从而激活下游信号通路，如介导肌动蛋白细胞骨架的重排。SopE和SopE2在基因序列上有70%的同源性，但是它们却具有不同的底物：SopE可以作用于Rac1和Cdc42，而SopE2似乎只特异性的作用于Cdc42。

SptP是由SPI-1 TTSS编码的效应蛋白，具有耐高温和耐盐性[8]，它的分泌需要分子伴侣SicP的协助[9]。一旦沙门菌进入细胞，SptP将下调Cdc42和Rac-1，导致细胞膜褶边的终止和逆转，从而介导宿主细胞的细胞骨架恢复到静息状态。SptP与SopE是一对功能相反的蛋白，N端含有GTP酶活化蛋白(GTPAase active protein，GAP)结构，能够促进GTPAase与GDP结合，从而加速其水解，最终使得细胞膜骨架重排。

2 沙门菌效应蛋白介导的SCV的形成以及胞内存活

沙门菌进入宿主细胞后，在胞浆内形成一种膜泡结构，即SCV泡(Salmonella containing vacuole，SCV)。SCV是沙门菌在细胞内存活和不断增殖的重要结构。它的形成和成熟包括三个阶段：早期、中期和晚期。早期的SCV膜表面集聚有许多的初级内体膜标记蛋白EE，接着EE就会被溶酶体相关膜蛋白1 (lysosome-associated membrane protein 1，LAMP-1)所替代。在随后的1～2 h内SCV会从细胞边缘转移到中心粒附近。4～6 h后细菌开始在胞内复制，并伴有沙门菌诱导纤丝(Sifs)开始从SCV表面辐射延伸[10]。

在SCV形成早期，T3SS-1效应蛋白SopB发挥磷酸肌醇磷酸酯酶的活性将宿主细胞的Rab5招募至吞噬体膜上，从而刺激PI(3)P(3-磷酸酯酰肌醇)的生成以及活化Akt激酶信号级联通路并促进LAMP-1向SCV的转移[11]。在早期SCV形成过程中，SopB促使SNX1在细菌周围形成一种管状网织结构，并与SNX2共同运输M6PR(甘露糖6磷酸受体)到外侧高尔基体网络[12]。SopB还介导SNX3的形成[13]。SNX1、SNX2和SNX3即分类连接蛋白(sorting nexin，SNXs)含有PX(phoxhomology)区域，可与PI(3)P相互作用，在胞内运输过程中发挥着重要的作用。一旦将SNX3敲除，便抑制了LAMP-1向SCV的迁移，因此SNXs是SCV成熟的重要条件。SopB不仅可定位于细胞膜表面，促进细胞骨架重排，协助细菌侵袭，而且还能抑制溶酶体与SCV膜的融合。如图1所示，一旦敲除SopB，沙门菌不但无法利用Rab5及PI(3)P促进SCV的完全成熟，并且还会减少初生SCV膜表面的电荷，导致细胞内吞噬作用相关转运蛋白如(Rab8b、13、23、35)无法从膜表面解离，从而无法抑制溶酶体与SCV膜的融合[14]。因此，SopB对细菌避免溶酶体的溶解及促进细菌在胞内的存活具有重要的意义。

图1 SopB抑制溶酶体与SCV的融合[14]

另外，在SCV逃避溶酶体降解的过程中一些蛋白也同样发挥了重要的作用，如Rab9、Rab14和Rac1等。应用相应的siRNA沉默Rab9、Rab14与Rac1之后，SCV的成熟时间将大大延迟[15]。然而有一些T3SS-2效应蛋白也参与了SCV的生成与成熟，如SifA。SifA可诱导Sifs的形成以及在沙门菌内化后维持SCV的稳定。SifA能与SKIP(SifA与驱动蛋白结合蛋白)结合，对于SCV的结构的稳定以及调节SCV内细菌的位置与增殖是必不可少的[16]。

除了SifA，T3SS-2编码的效应蛋白SseG、SseF及SseJ在SCV的稳定及定位过程中也发挥了重要的作用。特别是SseJ，它具有胆固醇酰基转移酶活性，能够促进SCV在高尔基体上的定位以及促进Sifs的形成，这对于细菌的复制是非常重要的[17]。研究发现SipA的N端还具有定位功能，可以与SifA共同参与SCV的生物合成和成熟进而确保它在细胞核附近的定位[3]。

总之，T3SS-1和T3SS-2编码的效应蛋白在SCV成熟及定位方面发挥了重要的功能，这为细菌在SCV里复制和增殖创造了良好的环境。

3 沙门菌效应蛋白诱导的肠道炎症反应与细胞调亡

沙门菌进入细胞后，会通过T3SS-1编码的效应蛋白激发宿主一系列的促炎症反应以及调控细胞的凋亡。而宿主细胞的凋亡又能造成细菌的免疫逃逸。另外，还有一些效应蛋白能延长细菌在细胞内存活，给细菌营造一个良好的生存环境。

效应蛋白SopE与其同源的SopE2均能刺激肠道上皮细胞导致炎症和腹泻，同时还可以激活Rho家族的GTPases，从而触发Erk、JNk和p38MAPK等信号通路，这些蛋白会激活转录因子AP-1和NF-κB。NF-κB能释放趋化因子IL-8，进而促进炎症细胞的趋化和细胞增殖。最近有研究报道沙门菌SopE效应蛋白激活小分子GTPase引发NF-κB级联信号通路的过程需要NOD1参与[18]。除此之外，SopE还能利用Cdc42和Rac-1活化基质细胞的caspase-1的活性，释放IL-1和IL-18，从而引起黏膜炎症反应[19]

一旦宿主细胞信号通路被激活，细胞内环境会发生改变，将会抑制细菌在宿主内的存活和复制。然而，沙门菌却进化了一些能够克服不利环境的效应蛋白，如SptP。其C端含有一个蛋白酪氨酸磷酸酶结构域(PTPase)，这个结构域可帮助沙门菌在SCV里复制[20]。有研究显示，SptP可以抑制肥大细胞脱粒，进一步抑制嗜中性粒细胞的募集，阻止血管内容物流进感染部位，最终导致细菌的传播，从而引起细菌的全身性感染[8]。作为一种GAP，SptP能结合小分子GTPases并加速其水解，抑制其活性，进而抑制ERK/MAPK酶的活性最终下调MAPK信号通路。

图2 AvrA激活β-catenin/Wnt信号通路[23]

AvrA是SPI-1 T3SS的效应蛋白之一，普遍存在于沙门菌和大肠杆菌中。鼠伤寒沙门菌效应蛋白AvrA具有多种酶的功能，它在抑制炎症、调控细胞凋亡、促进细胞增殖等方面都具有重要的作用。AvrA主要通过调节JNK MAPK、NF-κB和β-catenin/Wnt三个宿主细胞内的信号通路来调节宿主的生理生化反应。其中，AvrA作为一种乙酰基转移酶可以磷酸化MKK4和MKK7从而下调JNK的表达，并且AvrA还能抑制TNFα的活性，抑制细胞内活性氧(ROS)含量的增加，促进了JNK的磷酸化，最终导致其失活并阻止被感染的巨噬细胞凋亡和细菌的快速传播[21]。AvrA还具有泛素化酶的功能，可作用于NF-κB，阻止NF-κB p65亚基的入核。另外，AvrA还能通过泛素连接酶E3阻止IκBα的去泛素化，抑制了IκBα的降解。而IκBα的降解和去泛素化是NF-κB通路引发炎症的必要条件[22]。因此，AvrA通过抑制NF-κB信号通路，最终抑制宿主的炎症反应，延长细菌在胞内的存活。另外，有研究证实AvrA可以调控β-catenin/Wnt通路。如图2所示：AvrA能够持续增强β-catenin的乙酰化和磷酸化，导致乙酰化和磷酸化的β-catenin转移到核上，从而激活Wnt信号通路，最终导致细胞增殖[23]。除此之外，NF-κB和β-catenin两个通路之间的相互作用也会影响宿主细胞的炎症反应，即活化的β-catenin可以抑制NF-κB的活性，间接稳定IκBα，抑制IL-8的分泌从而抑制炎症的发生[24]。

4 展 望

在细菌感染过程中，由SPI-1和SPI-2编码的沙门菌效应蛋白具有引发细胞膜结构重排、诱导炎症反应以及调控细胞凋亡等重要的功能。因此，这些效应蛋白在细菌致病过程中的功能仍然是当今研究热点，但大多以鼠伤寒沙门菌为模型，而其他血清型沙门菌效应蛋白的致病机理还有待进一步探究。随着人类对各种血清型沙门菌致病机理的深入研究，沙门菌病将得会到更好的防御和控制。

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Research progress on T3SS relative effector protein ofSalmonella

TANG Pei-pei,LIN Zhi-jie,PAN Zhi-ming,JIAO Xin-an

(KeyLaboratoryofZoonosesinJiangsuProvince,JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Salmonellais a pathogenic bacteria to human and animals, which can cause seriously complication and death.Salmonellapathogenicity is from the reactions of SP-1 and SP-2 T3SS effector proteins. In this paper, the functions of different T3ss effector proteins in different infection periods is reviewed to provide a reference for further understanding the pathogenesis mechanisms ofSalmonella.

Salmonella; T3SS effector proteins; functions

Pan Zhi-ming, Email: zmpan@yzu.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.019

国家自然科学基金(31172299, 31320103907)；教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-12-0745)；江苏省第九批“六大人才高峰”高层次人才项目(NY-028)；2012年度高校“青蓝工程”中青年学术带头人培养对象项目；江苏省研究生科研创新计划(KYZZ_0368)；江苏省高校优势学科建设工程项目联合资助

潘志明，Email: zmpan@yzu.edu.cn

扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009

R378.2

A

1002-2694(2015)03-0277-04

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2014-09-29；

2014-12-05