高 红，宋启发，徐景野，郑 剑，沈玄艺

宁波副溶血性弧菌临床株毒力基因与多位点序列分型研究

高 红，宋启发，徐景野，郑 剑，沈玄艺

目的 了解宁波地区副溶血性弧菌临床分离株毒力基因分布以及分子分型特征。方法 收集来源于食物中毒和散发腹泻患者副溶血弧菌菌株，利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热直接溶血素相关溶血素基因(trh)，利用多位点序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)进行分子分型。结果 2006—2012年共分离临床株248株，选择48株进行毒力基因和MLST分型研究。42株tdh+，为93.75%；11株trh+，为22.92%。48株菌株可分为9个ST型和一个未分型，ST3有32株，占66.67%； ST265有5株，占10.42%；ST120有3株，占6.25%。ST3克隆群中tdh+/trh-菌株有25株，占78.16%。与全国其他地区比较，在宁波临床株中发现ST262。结论 tdh+型是宁波地区副溶血性弧菌优势菌株。有9种ST型，以ST3克隆为主，其次为ST265和ST120。ST3克隆中以tdh+/trh-型为主。另发现1个独特的ST262菌株。

副溶血性弧菌；耐热直接溶血素基因；耐热直接溶血素相关溶血素基因；多位点序列分型

Funded by the Ningbo Municipal Science & Technology Bureau (Nos.2012B82018 and 2011C50041)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP) 是革兰氏阴性嗜盐细菌，属于弧菌科弧菌属，广泛存在于近海岸的海水、海水沉积物和鱼虾、贝类等海产品中及食品加工环境中[1]。1994—2005年在中国的细菌性食物中毒事件中副溶血性弧菌已居于首位[2]。2006-2011年浙江省共报告食物中毒突发事件106 起,以微生物类事件为主(占67.92%)，副溶血弧菌为最常见致病菌(占33.33%)[3]。2013年浙江省食源性疾病监测项目中副溶血性弧菌检出率最高，为3.7%，血清型以O3∶K6和O4∶K8为主。宁波市食源性疾病监测项目显示，副溶血性弧菌为散发性腹泻的主要病原，2013年在992份粪便和肛拭子中检测到50份阳性样品，阳性率为5.04%。耐热直接溶血素(Thermostable direct hemolysin, TDH)和耐热直接溶血素相关溶血素 (TDH-related hemolysin, TRH)是其主要致病物质，可引起肠袢肿胀、充血和肠液潴留而导致腹泻[4-5]。目前在浙江省的副溶血性弧菌临床株中发现了ST3、ST120和ST8[6]。为掌握宁波地区临床株副溶血性弧菌毒力基因分布以及分子分型特征，特进行相关研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株分离 将食物中毒和急性腹泻患者粪便或肛拭子直接接种TCBS培养基，37 ℃培养24 h，挑选可疑菌落进行革兰染色、氧化酶试验和观察动力。动力阳性氧化酶试验阳性的阴性弧采用法国生物梅里埃公司的VITEK-32仪器进行系统生化鉴定。

1.2 引物合成 tdh上游引物tdh-f: 5′- CGGTTCTGATGAGATATTGT-3′和下游引物tdh-r：5′- TCTGGAGTTTCATCCAAATA-3′,扩增产物为363 bp；trh基因上游引物trh-f：5′-TCAGTATCTAAATCATTCGC-3′和下游引物trh-r：5′-CATAACAAACATATGCCCAT-3′，扩增产物为471 bp；多位点序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)扩增和测序引物参考文献[7]。

1.3 副溶血性弧菌基因组DNA的提取 采用Takara公司的MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒(3.0版)，按照试剂说明书提取副溶血性弧菌基因组DNA。

1.4 tdh和trh检测 采用Takara公司Premix TaqTM(2.0版) 试剂盒，按照试剂说明书配制PCR反应体系。tdh扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。trh扩增条件：退火温度为58 ℃，其余同上。取扩增产物10 μL点样于1%琼脂糖凝胶(内含溴化乙锭最终浓度为0.5 μg/mL)，电压10 V/cm，电泳30 min，暗室内紫外光下(波长254～365nm)观察电泳结果，观察是否有预期分子量大小的条带出现。

1.5 副溶血性弧菌MLST扩增、测序和数据分析 副溶血性弧菌MLST方法参考文献[7]，选择副溶血性弧菌的7个管家基因adk、fumc、gyrB、icd、mdh、purA 和recA 进行PCR，扩增产物利用ABI3730全自动基因分析仪(上海英骏公司)采用测序引物对扩增的片段进行正反方向核苷酸序列测定，测序结果利用软件Chromas编辑和拼接，利用软件Bioedit进行校正，校正后的序列与副溶血弧菌MLST标准数据库(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)进行比对，获得各管家基因的等位基因数值，并形成相应的等位基因谱，判断其序列型(sequence type,ST)。利用Mega6.0对7个管家基因核苷酸串联序列构建系统进化树，利用eBURST V3软件对ST进行分析。参考菌株来自副溶血弧菌MLST标准数据库。

2 结 果

2.1 tdh和trh毒力基因分析 2006—2012年共分离到248株副溶血性弧菌临床株，选择48株菌株进行毒力基因和MLST分型研究，2006年10株，均来自于一起食物中毒事件，2007年8株，2009年10株，2010年6株，2011年5株，2012年9株。48株菌株中42株tdh+，为93.75%；trh+11株，为22.92%；9个菌株为tdh+/trh +，4个菌株为tdh-/trh-。

2.2 副溶血性弧菌MLST分型结果 48株菌株可分为10个ST型。ST为3的菌株有32株，占66.67%；其次为ST为265的菌株有5株，占10.42%；ST为120的菌株有3株，占6.25%。2012年分离的F2012289菌株7个管家基因的等位基因分别为dnaE234、gyrB4、recA162、dtdS222、pntA、pyrC184和tnaA79，在数据库中无匹配的ST。菌株毒力基因分布与MLST分型结果见表1。

2.3 副溶血性弧菌临床株eBURST V3软件分析结果 从副溶血弧菌MLST标准数据库选择中国分离的副溶血性弧菌临床株作为参照，利用eBURST V3软件绘制菌株ST分布图。数据库中中国副溶血性弧菌临床株共有105株，分为84个ST。其中ST为3的菌株有12株，占11.43%；ST为8的菌株有3株,占2.86%。在宁波临床株中发现特殊的ST262，在全国其他地区临床株中未出现。

2.4 7个管家基因连接序列Mega6.0软件分析结果 47个能进行ST分型的菌株按照形成ST的顺序将7个管家基因连接成长度为3 682 bp的多基因序列，利用Mega6.0软件采用Maximum Likelihood方法绘制系统进化树。从图中可知47株临床株在进化树上位于3个主要的分支上，7个管家基因中recA的变异最大。具体结果见图2。

3 讨 论

TDH具有溶血活性、细胞毒性、心脏毒性以及致死性等生物学活性，是副溶血性弧菌的主要毒力因子，与副溶血性弧菌的致病力具有高度相关性[4,8]。TRH具有溶血作用和肠毒素作用，是副溶血性弧菌的另一个重要的毒力因子。在48株宁波临床株中tdh+为93.75%，占据优势地位，与菌株致病性高度相关；trh+为22.92%；9个菌株为tdh+ /trh+,这与多篇文献报道的临床分离株中大多为tdh+/trh-，少量为tdh+ trh+的实验结果相一致[9-10]。4个菌株为tdh- /trh-，杨小蓉等对不携带tdh或trh的菌株进行小鼠毒力实验, 表明不携带毒力基因的菌株也具有致病性[11]。因此仅仅根据能否检测到tdh或trh毒力基因来判断菌株是否具有致病性是错误的。

表1 副溶血性弧菌毒力基因和MLST分型结果

注：数字表示ST，绿色为宁波临床株特有ST，黑色为全国临床株ST，红色为两种来源均有。

全球副溶血性弧菌已经有610种ST型，5种ST型最为常见(ST3、ST36、ST34、ST83和ST8)[7]。按照ST单点变异型(single-locus variant,SLV)值≥3为一个克隆群，具有最大SLV值的ST为主要起源，经eBURST V3分析显示，中国临床株ST分布存在3个克隆群(ST3、ST120和ST345)，最大克隆群为ST3并且是主要起源克隆群(SLV=8)。从图2可知ST3克隆群2006—2012年在宁波临床株中一直处于优势地位，与以上结果保持一致。2006年分离的9个菌株来自于一起食物中毒事件，这9个菌株均为tdh+/trh-菌株，且ST均为3，本研究表明该起食物中毒可能由单一ST菌株引起。

注：菌株名称前数字为ST,右侧条图黑线表示与1号菌株相比该处核苷酸有差异。

与全国其他地区临床株比较，宁波有1个特殊的ST262。ST262菌株分离自2011年，只有1株，在副溶血弧菌MLST标准数据库中查询得知，该型菌株1984年首次在日本腹泻病人中分离到，1990年和1991年在泰国腹泻病人中检出，在我国是首次报道分离到该型菌株。ST265菌株在1990年泰国腹泻病人和2007年中国环境中分离到，在2007—2012年深圳的食源性疾病监测中127株副溶血性弧菌中有14株ST265[12]。本次研究在48株菌株中检测到5株，分离年份为2007年、2009年、2010年和2012年，说明该型菌株除了在环境中存在外，还能在腹泻病人中流行。ST265属于ST345克隆群，而宁波和深圳均未发现ST345菌株，ST265可能是ST345克隆群在中国的主要流行株。

宁波地处我国东部沿海，这里的人们喜欢生吃半生吃各种小海产品，是副溶血性弧菌感染的高发区，与临近的日本、泰国等地交流频繁，因此掌握副溶血弧菌分子流行特征对副溶血弧菌的主动监测、暴发调查和追踪溯源具有十分重要的意义。

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Virulence gene detection and multi-locus sequence typing ofVibrioparahaemolyticusfrom patients in Ningbo, China

GAO Hong,SONG Qi-fa,XU Jing-ye,ZHENG Jian,SHEN Xuan-yi

(NingboCenterforDiseaseControlandPrevention,Ningbo315010,China)

To investigated the toxin genes distribution and molecular characteristics ofVibrioparahaemolyticusfrom patients in Ningbo,V.parahaemolyticusstrains were collected from patients with food poisoning and diarrhea. Thermostable direct hemolysin gene (tdh) and TDH-related hemolysin gene (trh) were detected by polymerase chain reaction (PCR). Molecular characteristics were acquired by multi-locus sequence typing (MLST). Of 248 clinical strains were isolated from 2006 to 2012. Forty-eight strains were selected to detect virulence genes and MLST genotyping. Forty-two isolates were detected as tdh+ and 11 isolates were detected as trh+. There were 9 STs and one undifferentiated type in Ningbo clinical strains. Thirty-two strains were classified into ST3, 5 strains into ST265 and 3 strains into ST120. ST265 was found in Ningbo strains compared with strains from other regions of China. Strains with tdh+ accounted for the majority in Ningbo clinical strains. Twenty-five strains of ST3 clone were tdh+/trh-. There were 9 STs coexsited in Ningbo clinical strains. ST3 clone was dominant, followed by ST265 and ST120. Strains with tdh+/trh- were dominant in the ST3 clone. The unique ST262 was found in Ningbo clinical strains.

Vibrioparahaemolyticus; tdh; trh; multi-locus sequence typing

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.011

宁波市科学技术局基金项目资助(No.2012B82018，No.2011C50041)

宁波市疾病预防控制中心，宁波 315010; Email：gaohong@nbcdc.org.cn

R378.3

A

1002-2694(2015)03-0240-04

2014-07-16；

2014-09-24