毛玲玲，田 疆，雷 露，刘学升，张 巍，张眉眉，韩 悦，姚文清

辽宁省炭疽芽胞杆菌MLVA分型研究

毛玲玲1，田 疆1，雷 露1，刘学升1，张 巍2，张眉眉1，韩 悦1，姚文清1

目的 了解辽宁地区炭疽芽胞杆菌的流行特征及菌型基因特征。方法 通过多位点可变数目串联重复序列(Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis，MLVA)分型实验，对2001—2011年辽宁省分离到的6株炭疽芽胞杆菌分离株DNA进行检测，DNA指纹图谱使用BioNumerics 4.0 软件进行统计分析，得出聚类分析结果。结果 聚类分析发现，6株炭疽芽胞杆菌株可分为2个基因型。对于炭疽暴发而言，其可变数目串联重复序列遗传标记具有高度相似性。结论 炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标，在炭疽暴发事件中的病原体溯源上具有重要的意义。

炭疽芽胞杆菌；多位点可变数量串联重复序列分析；基因分型

炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)引起的一种人兽畜共患传染病，对农业和人类造成严重损害[1]。人类主要是通过接触患畜、进食感染炭疽的牲畜肉类、吸入含有菌体或芽胞的气溶胶、尘埃以及接触污染病菌的皮毛而感染本病。炭疽芽孢杆菌耐受不良环境的能力及其传染性和强致病性，使其成为首选的生物战剂之一，曾多次被恐怖分子用来发动生物恐怖袭击。

多位点可变数目串联重复序列(Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis，MLVA)[2]是近年发展起来的以PCR 为基础，根据被检菌株散在于基因组中不同位点的、变数量串联重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)的重复单元拷贝数的差异来进行分子分型的技术。Keim等选择炭疽芽胞杆菌6个染色体上的VNTR位点和2个质粒上的VNTR位点建立了MLVA-8[3]。历史上辽宁省很多地区都发生过炭疽疫情，并于近十年间多次发生较大规模暴发疫情，尤其是发生于2011年的炭疽疫情，波及我省2个地市，发病人数达30多例。为了解辽宁地区炭疽芽胞杆菌的流行特征及菌型基因特征，采用MLVA分型方法对辽宁省10年间分离到的6株炭疽芽胞杆菌进行基因分型研究。

1 材料与方法

1.1 材料 2001—2011年间，辽宁省分离自病人、外环境的6株炭疽芽胞杆菌分离株，经生化、药敏及噬菌体鉴定。菌株详细资料见表1。

1.2 主要仪器与试剂 核酸提取应用QIAGEN EZ1全自动核酸提取工作站，引物、Premix Ex Taq均由大连宝生物技术有限公司提供，PCR产物测序工作由北京英俊生物工程技术服务有限公司完成。

1.3 方法 采用MLVA-8(8位点可变数目串连重复序列)分型方法，引物序列、扩增体系及反应条件见文献[1，3]，表2。MLVA反应体系包括10×缓冲液(Mg2+1.5 mol/L)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.5 μL，引物(10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板1 μL，用灭菌蒸馏水补至25 μL。扩增参数：95℃预变性5 min，然后以95 ℃变性20 s、60 ℃退火20 s、65 ℃延伸3 0s，进行34个循环，末轮65 ℃延伸5 min。PCR产物由北京英俊生物工程技术服务有限公司进行测序，得到产物片段的大小。

1.4 数据分析 根据PCR产物大小，采用Bio Numerics 4.0软件，利用非加权配伍组平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)聚类分析。

表1 菌株背景资料

表2 炭疽芽胞杆菌MLVA-8引物序列

2 结 果

采用MLVA-8分型方法(vrrA、vrrB1、vrrB2、vrrC1、vrrC2、CG3、pxO1、pxO2)对6株炭疽芽胞杆菌进行分析。根据其产物大小聚类分析发现，6株炭疽芽胞杆菌株可聚类为2个基因型(见图1)。基因1型中包含2株菌，分离于2011年暴发疫情的2个病例。基因2型中包含分离自两个地区不同年份的4株炭疽菌。

3 讨 论

目前，基因分型技术广泛应用于各种病原微生物的研究，MLVA方法是众多基因分型方法中较为成熟的一种[2]。MLVA具有快速简便、分辨力高和重复性好、结果易于数字化的特点。目前该方法已广泛应用于鼠疫耶尔森菌、结核分枝杆菌[2]、布鲁氏菌以及肠炎沙门菌等一些细菌的分型分析。由于炭疽芽孢杆菌遗传变异水平低的特点，MLVA是少数几种可用于鉴别炭疽芽孢杆菌菌株之间差异的分子分型方法。Keim等[3]选择炭疽芽胞杆菌6个染色体上的VNTR位点和2个质粒上的VNTR位点建立MLVA-8后，对全世界各地所分离的426株炭疽芽孢杆菌进行MLVA分析，鉴定出89个基因型，聚类分析分为6个主要基因群，其中A3集群分布非常普遍。我国王秉翔等[1]用MLVA8分析来自中国的193株炭疽芽孢杆菌菌株，并揭示了21种新的基因型；聚类分析显示A、B、C等3个集群。魏建春等[4]选取11个位点，对109株来自全国的炭疽菌株进行了分析，结果提示新疆的菌株类型较复杂。

图1 6株炭疽芽胞杆菌MLVA聚类分析图

本研究采用炭疽芽胞杆菌MLVA-8分型引物，对我省的炭疽芽胞杆菌进行分析。结果表明， 6株炭疽芽胞杆菌株可聚类为2个基因型，将其基因型与Keim[3]的结果相对照，均属于常见的A3集群，该集群在我国分布最为广泛。对照王秉翔[1]的研究结果，基因1型曾在北京、广西、河北、山东、新疆的炭疽分离株中发现，在辽宁发现此基因型尚属首次。本次研究中的基因2型与王秉翔[1]的研究结果一致。有4株分离株聚类到基因2型中，这4株菌分离于两个地区的不同年份，该基因型是否为辽宁本地主要流行型别尚待进一步监测研究证实。本次研究中的1、2、3号分离株来源于2001年的暴发疫情及其监测，5、6号分离株分离于2011年同一起暴发疫情的2个病例，相同暴发疫情的分离株同源性达100%，因此对于暴发疫情分离到的炭疽菌株而言，其可变数目串联重复序列遗传标记具有高度相似性。

MLVA技术在炭疽感染事件中追溯传染源，甚至菌株的鉴定方面，是一种很好的分析方法。2001年美国“9.1l”炭疽恐怖事件，Hoffmaster等[5]应用MLVA技术分析了来自炭疽事件标本分离到的135株菌，所有的菌株都为同一基因型，并且与实验室使用的Ames菌株一致。Keim等[3]应用MLVA技术对日本奥姆真理教炭疽事件中的菌株进行了回顾性研究，发现48株菌有一致的基因型，与Sterne菌株的基因型一致。

综上所述，通过MLVA分析可以从分子流行病学角度及时发现暴发疫情。对传染源的追踪，暴发流行调查、生物恐怖事件病原体的溯源具有重要的作用。因此建立我省的炭疽芽胞杆菌菌株MLVA数据库资料，对于炭疽的防控、打击恐怖主义和反生物武器具有重要意义。

[1]Wang BX, Smith KI, Keys C, et al. Molecular epidemiology ofBacillusanthracisin China[J].Prog Microbiol Immunol, 2002, 30(1): l4-l7. (in Chinese) 王秉翔, SmithKL, Keys C, 等. 中国的炭疽杆菌DNA分型及其地理分布[J]. 微生物学免疫学进展, 2002, 30(1)：14-17.

[2]Barlow RE, Gascoyne-Binzi DM, Frothingham R, et al. Rapid identification of laboratory contamination withMycobacteriumtuberculosisusing variable number tandem repeat analysis[J] . J Clin Microbiol, 2001, 39(1): 69-74. DOI: 10.1128/JCM.39.1.69-74.2001

[3]Keim P, Price LB, Klevytska AM, et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships withinBacillusanthracis[J]. J Bacterio1, 2000, 182(10): 2928-2936. DOI: 10.1128/JB.182.10.2928-2936.2000

[4]Wei JC, Zhang EM, Zhang HJ, et al. Characteristics and distribution of 11 variable number tandem repeats ofBacillusanthracisin China[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28(8): 765-768. (in Chinese) 魏建春, 张恩民, 张慧娟, 等. 中国炭疽芽胞杆菌中11个串联重复序列位点的特征和分布[J] . 中国人兽共患病学报, 2012, 28(8)：765-768.

[5]Hoffmaster AR, Fitzgerald CC, Ribot E, et al. Molecular subtyping ofBacillusanthracisand the 2001 bioterrorism--associated anthrax outbreak, United States bioterrorism-related anthrax[J]. Emerg Infect Dis, 2002, 8(10): 1111-1116.

Bacillusanthracisisolates analysis by multiple-locus variable-numbers of tandem repeats analysis, Liaoning, China

MAO Ling-ling1,TIAN Jiang1,LEI Lu1,LIU Xue-sheng1, ZHANG Wei2,ZHANG Mei-mei1,HAN Yue1,YAO Wen-qing1

(1.LiaoningCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenyang110005,China; 2.AnshanCenterforDiseaseControlandPrevention,Anshan114009,China)

The epidemic characteristics and genotype ofBacillusanthracisstrains in Liaoning Province, China was analyze in this study. SixBacillusanthracisstrains from 2001 to 2011 were studied with multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA). BioNumerics4.0 software was used to analyze the DNA fingerprint of statistics, and cluster analysis results were obtained. Clustering analysis found that the 6 strains could be divided into two genotypes. For anthrax outbreaks, the genetic markers of multiple-locus variable-number tandem repeat were highly similar. It's suggested that MLVA is quite useful for investigation of strain relatedness in regions of outbreaks.

Bacillusanthracis; multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis; genotype

Yao Wen-qing, Email: yaowenqing@lncdc.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.009

国家科技重大专项 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治项目(2012ZX10004-209)

姚文清， Email: yaowenqing@lncdc.com

1.辽宁省疾病预防控制中心， 沈阳 110005； 2.鞍山市疾病预防控制中心,鞍山 114009；

R378.7

A

1002-2694(2015)03-0232-03

Supported by the National Sci-Tech Key Project of China (No. 2012ZX10004-209)

2014-05-29；

2014-10-09