杨 宁，张 雪，张传山，吕国栋，李 亮，刘欢元，王 慧

细粒棘球蚴自发荧光观察及光谱特征分析

杨 宁，张 雪，张传山，吕国栋，李 亮，刘欢元，王 慧

目的 研究细粒棘球蚴的自发荧光现象及共聚焦λ扫描特点，丰富细粒棘球蚴光谱学和生物学信息，为后期免疫荧光及医学光子学研究奠定基础。方法 采集自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏,在无菌条件下收集包囊内的原头蚴进行体外培养，亚甲基蓝染色确定原头蚴活力。激光扫描共聚焦显微镜下分别以405 nm、488 nm、514 nm、561 nm等不同激发光激发观察虫体自发荧光，并分别对这5种激发光激发的细粒棘球蚴做自发荧光λ扫描分析，同时采用全波长多功能酶标仪下分别以405 nm、488 nm、514 nm、563 nm、633 nm等5种激发光激发细粒棘球蚴，绘制其自发荧光曲线。结果 经亚甲基蓝染色测定原头蚴活力为100%。共聚焦显微镜观察不同激发光照射下细粒棘球蚴虫体能发出多种不同颜色的自发荧光。在相同的激发强度及探测器电压的情况下，以405 nm激光激发的蓝色荧光效果最佳，虫体大体结构清晰；λ扫描分别以405 nm、488 nm、514 nm、561 nm、633 nm等5种激发光激发样品，相应敏感的发射波长分别为490～520 nm、520 nm及580 nm左右、580～600 nm、610～630 nm和650 nm左右，其中405 nm、488 nm和561 nm激发效果较好，514 nm、633 nm激发效果欠佳。全波长多功能酶标仪检测细粒棘球蚴做自发荧光曲线与共聚焦显微镜结果基本一致，但所测定的虫体自发荧光强度较共聚焦显微镜偏低。结论 激光扫描共聚焦显微镜下可观察到细粒棘球蚴虫体自发荧光，其中以405 nm激发的蓝色荧光最强；细粒棘球蚴虫体自发荧光光谱较宽，490～520 nm、610～630 nm，405 nm、488 nm和561 nm为较适宜的激发波长。

细粒棘球蚴；自发荧光；共聚焦显微镜

包虫病又称棘球蚴病，是棘球绦虫寄生于人体及某些动物体内所致的一种人兽共患慢性寄生虫病，严重危害人民身体健康和畜牧业的发展。根据多地的医院资料统计，人体包虫病中大约97%是由感染细粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus, Eg)引起的囊性包虫病(Cystis Echinococcosis, CE)，而泡型包虫病不超过3%[1]。目前，囊型包虫病的治疗以外科手术为主，药物为辅，但手术对人体损伤大且复发率高，长期服用阿苯哒唑等药物可产生严重的不良反应，针对细粒棘球蚴的候选抗原分子诱导的保护效果仍不够理想。因此，通过对细粒棘球蚴的自发荧光特性的研究和分析进一步发现其在免疫学水平或医学光子学的变化规律，对于研发新的检测或治疗方法是非常必要的。

自发荧光是一种物理现象，当用一种波长的光(如紫外线)照射某物质时，这种物质会在极短的时间内发射出较照射波长的光(可见光)，这种光被称为自发荧光。组织经物理或化学胁迫后发出的自发荧光，称为诱导自发荧光；而固有的非胁迫的自发荧光称为自然自发荧光。现今关于生物组织自发荧光的研究多集中在植物学[2]。在医学领域，自发荧光的研究目前主要集中在视网膜疾病和恶性肿瘤的辅助诊断领域[3-5]，有关动物组织自发荧光的研究较少[6]。目前，国内外关于棘球绦虫及棘球蚴组织的自发荧光尚未见报道。随着近年来生物医学光子学的骤然兴起，亟待开展该领域相关研究工作。本研究借助全波长多功能酶标仪和激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)对细粒棘球蚴虫体的自然自发荧光(以下简称自发荧光)特性进行描述和分析，为后期免疫荧光及医学光子学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂及耗材 徕卡TCS-SP8激光扫描共聚焦显微镜、赛默飞世尔Varioskan Flash全波长多功能酶标仪。细粒棘球蚴培养液组分：改良型RPMI-1640培养基(购自Hyclone公司，货号SH30809.01B)、胎牛血清(FBS，购自Hyclone公司，货号SV30184.01)、酵母(yeast extract,购自OXOID公司，货号LP0021)、葡萄糖(D-glucose anhydrous，购自Solarbio公司，货号G8150)、磷酸盐缓冲液(PBS，购自Hyclone公司，货号SH30256.01B)。所有培养基组分均通过0.22 μm滤器过滤除菌。玻底小皿(购自NEST公司，货号801001)、96孔细胞培养板(购自Costar公司，货号3599)。

1.2 细粒棘球蚴的分离培养 细粒棘球蚴包囊采自新疆乌鲁木齐市屠宰场包虫自然感染细粒棘球蚴的新鲜绵羊肝脏，从完整的包囊中，无菌条件下抽取囊液，分离原头蚴(PSC)[7]，经胃蛋白酶37℃消化15～30 min，用无菌PBS洗3遍后，待其自然沉淀，将上清尽量弃去，亚甲基蓝染色鉴定虫体活力，计数后按2000 PSCs/mL密度进行培养。

1.3 自发荧光的共聚焦成像 取适量PSC于玻底小皿中，在共聚焦显微镜下分别通过蓝色(DAPI通道，激发波长405 nm，检测波长430～550 nm)、绿色(FITC通道，激发波长488 nm，检测波长500～550 nm)、黄色(EYFP通道，激发波长514 nm、检测波长525～600 nm)、红色(TRITC通道、激发波长561 nm、检测波长570～700 nm)4个通道进行拍摄，各通道拍摄参数均保持一致，分别为Zoom factor 放大系数1.00，扫描频率200 HZ，Line average 3次，激光强度50%，采用HyD探测器进行信号检测，探测器电压200%。

1.4 自发荧光变化曲线的共聚焦测定 利用玻底小皿在共聚焦显微镜下以5种激发光激发细粒棘球蚴做自发荧光λ扫描分析绘制自发荧光曲线。①激发波长405 nm，检测波长430～700 nm；②激发波长488 nm，检测波长500～700 nm；③激发波长514 nm，检测波长540～700 nm；④激发波长561 nm，检测波长580～700 nm；⑤激发波长633 nm，检测波长650～750 nm。各通道扫描参数均保持一致，分别为Detection band width 20 nm，λ-Detection stepsize 20 nm，Line average 3次，扫描频率600 HZ，激光强度50%，采用HyD探测器进行信号检测，探测器电压200%并根据虫体形态划定ROI。

1.5 自发荧光变化曲线的全波长多功能酶标仪测定 利用96孔板在全波长多功能酶标仪下以5种激发光激发细粒棘球蚴绘制自发荧光曲线。①激发波长405 nm，检测波长430～700 nm；②激发波长488 nm，检测波长500～700 nm；③激发波长514 nm，检测波长540～700 nm；④激发波长561 nm，检测波长580～700 nm；⑤激发波长633 nm，检测波长650～750 nm。各通道扫描参数均保持一致，分别为Measurement time 1000 ms，Excitation band width 5 nm，Optics模式为Bottom，每孔约为1 000个原头蚴左右，2次重复。

2 结 果

2.1 细粒棘球蚴的分离培养 对新鲜采集的细粒棘球蚴进行亚甲基蓝染色鉴定虫体活力并计数，结果显示虫体活力为100%，每mL虫体沉淀约达7万枚PSC，见图1。

2.2 自发荧光的共聚焦成像 共聚焦显微镜下通过蓝色(DAPI通道，激发波长405 nm，检测波长430～550 nm)、绿色(FITC通道，激发波长488 nm，检测波长500～550 nm)、黄色(EYFP通道，激发波长514 nm、检测波长525～600 nm)、红色(TRITC通道、激发波长561 nm、检测波长570～700 nm)4个通道进行拍摄，发现在相同的激发强度及探测器电压的情况下，以405 nm激光激发的蓝色荧光效果最佳，虫体大体结构清晰，561 nm激光激发的红色荧光效果及488 nm激光激发的绿色荧光效果其次，514 nm激光激发的黄色荧光较弱，见图2。

(10 × object glass)

(A)可见光；(B) 405 nm激发；(C) 488 nm激发；(D)514 nm激发；(E)561 nm激发

2.3 自发荧光变化曲线的共聚焦测定 共聚焦显微镜下扫描分别以5种激发光激发细粒棘球蚴做自发荧光λ扫描分析绘制自发荧光曲线。①激发波长405 nm，检测波长430～700 nm；②激发波长488 nm，检测波长500～700 nm；③激发波长514 nm，检测波长540～700 nm；④激发波长561 nm，检测波长580～700 nm；⑤激发波长633 nm，检测波长650～750 nm。相应敏感的发射波长分别为490～520 nm、520及580 nm左右、580～600 nm、610nm～630 nm和650 nm左右，其中405 nm、488 nm和561 nm激发效果较好。514 nm、633 nm激发效果欠佳，自发荧光曲线见图3。

(蓝色)405 nm激发；(绿色)488 nm激发；(黄色)514 nm激发； (红色)561 nm激发；(紫色)633 nm激发

2.4 自发荧光变化曲线的全波长多功能酶标仪测定 全波长多功能酶标仪以5种激发光激发细粒棘球蚴绘制自发荧光曲线。①激发波长405 nm，检测波长430～700 nm；②激发波长488 nm，检测波长500～700 nm；③激发波长514 nm，检测波长540～700 nm；④激发波长561 nm，检测波长580～700 nm；⑤激发波长633 nm，检测波长650～750 nm。实验中发现全波长多功能酶标仪测定的细粒棘球蚴的自发荧光曲线其变化趋势与共聚焦显微镜测定的结果基本一致，但其测定得到的荧光强度与共聚焦显微镜测定的结果相比很弱，见图4。

3 讨 论

免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，是基础研究中的一种很好的高灵敏度、高效的示踪技术手段。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。然而生物体中自身具有的某些物质可在一定波长的光刺激下发出荧光，称为自发荧光。在实际研究中，经常会发生自发荧光与所选用的荧光抗体之间出现串扰的情况，造成的假阳性及实验结果的判读上的困难，如果在选择荧光抗体上合理的规避所要研究的生物体的自发荧光是每一位研究人员都需要考虑的问题。本文所得到细粒棘球蚴的虫体自发荧光的变化规律将有助于指导囊性包虫病基础研究中荧光抗体的合理选择。

生物组织自发荧光的主要物质来源有氨基酸、结构蛋白、酶和辅酶、维生素、类脂物和卟啉等，生物荧光光谱学性质是不同组织、不同结构、不同生化和物化特性等生物组织本质信息的真实反映[8]。近年来，利用生物组织的光学特性来判别组织性质和功能已成为生物医学研究和诊断的一个重要手段[9-10]，在囊性包虫病研究领域开展免疫学、生物医学光子学工作对包虫病的诊断防治研究有着积极意义，细粒棘球蚴的不同应激状态或免疫状态下的自发荧光有何变化规律，未来是否可能通过观察虫体自发荧光的变化而进行药效学或医学诊断学研究将是一个具有吸引力的切入点[11]。

(A) 405 nm激发；(B)488 nm激发；(C)514 nm激发；(D)561 nm激发；(E)633 nm激发；(F)阴性对照

自发荧光变化曲线是衡量生物体在受到一种激发光刺激后机体内的某些荧光物质在整个光谱中发射荧光的变化规律的一种方式。本实验采用激光扫描共聚焦显微镜、全波长多功能酶标仪两种不同仪器对细粒棘球蚴虫体的自发荧光变化曲线进行了测定。测定结果发现，两种测定方式所得到的虫体的自发荧光变化趋势基本一致，但在同样的激发波长下，激光扫描共聚焦显微镜所测定的自发荧光强度要远高于全波长多功能酶标仪。通过对两种仪器测定原理及参数设定的比较发现，在大部分测定参数水平上，两个仪器是没有太大区别的，但全波长多功能酶标仪的检测带宽(Detection band width)只能为1 nm的范围，而激光扫描共聚焦显微镜则可以自由设定并且本实验中所设定的检测带宽(Detection band width)为20 nm，由于生物体的自发荧光，特别是细粒棘球蚴的自发荧光发射波长分布范围较宽，从430 nm至650 nm都有，并且有数个主要分布范围。由此，我们考虑细粒棘球蚴的自发荧光基本上是平均分布于每nm的光谱范围内的，仅仅1 nm上的自发荧光强度并不高，因此，全波长多功能酶标仪在细粒棘球蚴的自发荧光强度的检测上并不是很好的选择，只能用作定性的荧光分析。激光扫描共聚焦显微镜下可观察到细粒棘球蚴虫体自发荧光，其中以405 nm激发的蓝色荧光最强；细粒棘球蚴虫体自发荧光光谱较宽，主要分布于490～520 nm、610～630 nm。在应用免疫荧光技术研究细粒棘球蚴时应避免选择绿色荧光及浅红色荧光(如FITC、TRITC、GFP等)，以免自发荧光与所选用的荧光抗体之间出现串扰，造成实验结果的假阳性。

综上，本文首次描述了细粒棘球蚴体外培养条件下自发荧光及其共聚焦λ扫描特点，确定了细粒棘球蚴虫体自发荧光在不同波长的光激发下的敏感范围，为未来囊性包虫病在生物医学光子学及荧光基础研究领域的工作奠定了基础，同时对未来在囊性包虫病研究中的荧光抗体的选择具有重要的指导意义。

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Autofluorescence and spectrum characteristics ofEchinococcusgranulosusculturinginvitro

YANG Ning,ZHANG Xue,ZHANG Chuan-shan,LYU Guo-dong,LI Liang,LIU Huan-yuan,WANG Hui

(ClinicalMedicalResearchInstitute,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,XinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830054,China)

The objective of this study was to illustrate the autofluorescence phenomenon and scanning confocal λ characteristics ofEchinococcusgranulosus(Eg) culturedinvitro, which can not only rich the spectroscopy and biological information ofEg, but also lay a foundation for study the immunofluorescence and medical photonics. Protoscoleces (PSC) ofEgwere aspirated and pooled from sheep liver hydatid cysts collected from a slaughterhouse. The PSC viability was determined by Methylene blue staining. The autofluorescence of endocyst were observed through the confocal microscope excited respectively by 405 nm, 488 nm, 514 nm, and 561 nm. The autofluorescence curve was measured by thermo Varioskan Flash respectively by 405 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, and 633 nm. The λ scanning analysis was executed by confocal respectively by 405 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, and 633 nm to measure the autofluorescence curve. TheEgexcited by different excitation light through confocal showed different colors autofluorescence. Under the same excitation intensity and detector voltage condition, blue fluorescence showed the best fluorescence effect and clearer structure which excited by 405 nm laser. Scanning respectively by five different excitation lights, the corresponding sensitive emission wave lengths scope were 490-520 nm, around 520 nm and 580 nm, 580-600 nm, 610-630 nm, and around 650 nm, respectively. The 405 nm, 488 nm and 561 nm excitation effect were better than that of the 514 nm and 633 nm. The autofluorescence curve detected by Microplate Reader were basically as same as that by confocal, although the intensity detected by Microplate Reader were lower. The results indicated that the best excitation light to detect the autofluorescence ofEgis 405 nm, which showed blue fluorescence. The autofluorescence spectrum ofEgis wide, mainly in 490-520 nm and 610-630 nm. The better excitation wave lengths are 405 nm, 488 nm and 561 nm.

Echinococcusgranulosus; autofluorescence; confocal

Wang Hui, Email: wang_hui6319@sina.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.007

国家自然科学基金项目(No. 81201304) ，新疆维吾尔自治区包虫病基础医学重点实验室开放课题(XJDX0202-2013-9)联合资助

王慧，Email: wang_hui6319@sina.com

新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院，乌鲁木齐 830054

R383.3+3

A

1002-2694(2015)03-0222-05

Funded by the National Natural Science Foundation of China (No. 81201304) and the Xinjiang Key Laboratory of Hydatid Fundamental Medicine (No. XJDX0202-2013-9)

2014-04-10；

2014-08-05