李 浩，赫晓霞，曹玉玺，聂 凯，刘 岩，何 英，高晓艳，付士红，王环宇

Flanders病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立

李 浩1，赫晓霞1，曹玉玺1，聂 凯1，刘 岩2，何 英1，高晓艳1，付士红1，王环宇1

目的 应用TaqMan PCR技术建立针对Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)的实时荧光定量PCR检测方法。方法 下载GenBank中FLAV基因序列资料并进行多序列比对分析，选择其L基因中的高保守序列片段进行FLAV特异引物与探针的设计，使用来自于不同科属的15株病毒验证方法特异性，通过重复/平行实验验证方法稳定性，并利用体外转录的L基因RNA标准品建立基因拷贝数绝对定量分析模型。结果 引物与探针工作特异性良好，同一样品重复检测Ct值的变异系数均小于1.7%，定量分析模型灵敏度达到100 copies/PCR。结论 建立完成针对FLAV的TaqMan PCR检测方法。实验结果显示，本方法具有高特异性、高敏感性、高稳定性、简便、易操作的特点，为今后对FLAV的检测、监测及相关研究提供技术手段。

Flanders病毒；TaqMan RT-PCR;分子检测

Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，但目前还未进行明确分类[1]。FLAV是一种单股负链的RNA病毒，库蚊是其最主要的传播媒介，主要的宿主为野生鸟类，其首次被发现于1961年，以发现地“Flanders”命名[2-4]。“Flanders”是位于美国纽约州的一个小村庄，因为拥有相对较长的海岸线，成为蚊子理想的栖息地[2,5]。Flanders病毒的抗原反应与Hart Park病毒(Hart Park virus，HPV)较为接近，但又有所不同[3]。目前人类对FLAV感染人体后所造成的特异性临床症状，还没有确切的认识。因此，人类对该病毒感染和传播的预警尤为困难。

虽然，我国目前尚未发现FLAV的感染与传播，但随着我国社会经济的发展和日益增多的国际交流与合作，一些国外其他地区流行的疾病与病原体传入我国的风险日益增高。根据美国经验显示，FLAV在其东部不少地方的蚊媒监测中出现的频率，要高于其它常见的致病性虫媒病毒，如西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)等。所以理论上，FLAV完全可以作为WNV等虫媒病毒哨点监测的对象，建立针对FLAV的监测与检测能力，可以有效提高我国对外来虫媒病毒病的发现和预警能力。本研究利用TaqMan PCR技术建立针对FLAV的Realtime PCR方法，具有高特异性、高敏感性、高稳定性、简便、易操作的特点，为今后对FLAV的检测、监测及相关研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 引物、探针的设计 选择GenBank发表的全部2株FLAV中L基因序列进行全基因序列比对，根据TaqMan PCR引物、探针设计原则[6]，选择最为保守的区域作为扩增的目标基因片段。在此区域内利用Primer Express 3.0辅助设计引物及探针序列，并通过Blast分析验证其广谱性和特异性。引物由北京梓熙生物科技有限公司合成，探针由上海生工生物工程有限公司合成并标记，探针5′、3′端分别标记FAM荧光报告基团和TAMRA荧光淬灭基团。

1.2 FLAV阳性质粒标准品的合成及体外转录 根据引物及探针位置，设计合成FLAV中L片段基因高度保守区域(4774-4849)作为检测目标片段，并克隆至PGEM-Teasy载体中，基因合成与质粒克隆由北京梓熙生物科技有限公司完成。对克隆质粒中目标片段进行普通PCR扩增后，进行回收和纯化(TaKaRa公司GoTaq Green Master Mix，QIAgen公司Gel Extraction Kit)，再通过紫外核酸蛋白定量仪对回收的线性化DNA模板进行定量，用RiboMAX Large Scale RNA Production System T7(Promega公司)进行RNA体外转录并回收，回收的RNA通过紫外核酸蛋白定量仪进行定量，根据RNA序列的分子量进行浓度换算。以上实验操作均按照试剂盒要求进行。

1.3 TaqMan PCR检测体系的建立 通过优化，建立体积为25 μL/管的TaqMan PCR反应体系。反应体系组成：10 μmol/L的上下游引物与5 μmol/L的探针各1 μL，2×Reaction Buffer 12.5 μL和Enzyme Mix 1 μL(ABI公司，AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit)，RNA模板1 μL，剩余由DEPC水补齐。使用Mx3000P Real Time System(STRATAGENE公司)进行扩增。扩增条件为：45 ℃反转录10 min，95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s，40个扩增循环。

1.4 检测体系的特异性评价 利用本实验室储存的5科11种15株病毒的RNA与FLAV阳性质粒体外转录的RNA为模拟样本，进行FLAV Taqman RT-PCR检测体系的特异性验证。15株病毒信息如下：登革热病毒血清1-4型各1株、西尼罗病毒1株、乙型脑炎病毒基因1型和3型各1株、蜱传脑炎病毒1株、库蚊黄病毒1株，弹状病毒科狂犬病病毒1株，布尼亚病毒科Tahyna病毒1株、巴泰病毒1株，披膜病毒科甲病毒属盖塔病毒1株，呼肠孤病毒科版纳病毒1株和辽宁病毒1株。

1.5 检测体系标准曲线的绘制 使用RQ1 DNase对FLAV阳性质粒体外转录所得RNA进行消化，去除残留DNA后，利用紫外核酸蛋白定量仪对转录所得RNA进行定量，按照公式(6.02 ×1023)×(转录产物浓度ng/μL)/(转录产物RNA分子量)=copies/μL计算RNA拷贝数。通过系列稀释，获得101～104copies/μL 的4个不同浓度梯度的样品，进行Taqman PCR扩增与分析。根据不同浓度样品拷贝数和循环阈值(Ct)的对应关系绘制出定量标准曲线。

1.6 检测体系稳定性实验 对所获得的FLAV标准品，进行10-1～10-4梯度稀释，获得浓度分别为6×106～6×103copies/μL的4个不同浓度的RNA样品，以此为模板进行4次平行重复实验，对实验所获得的Ct值进行统计学分析，计算每个样品4次实验中Ct值的平均值(Mean)、标准差(S.D.)与变异系数(CV)，用以评价该检测体系的稳定性。

2 结 果

2.1 FLAV特异的引物与探针 设计合成的FLAV特异性引物与探针序列信息见表1，扩增目标片段长度为74 bp。

2.2 检测体系特异性 如图1所示，仅有FLAV的RNA得到成功扩增，其他毒株均无阳性扩增信号。

2.3 检测体系标准曲线 获得检测体系标准曲线方程为Y=-3.428×LOG(X)+41.25，R2=1.000。所建立方法最低检测限(LOD)为：100 copies/PCR。见图2。

2.4 检测体系稳定性 如表2所示， 各样品平行重复实验Ct值的标准差S均<0.5，变异系数CV均<1.7%，表明该检测体系稳定性良好。

表1 荧光定量PCR检测FLAV的引物与探针序列信息

注：引物和探针在基因组中的核酸位点依据的是FLAV毒株 61-7484(GenBank号为AF523199)序列。

Note: All the primers and probe were designed based on the whole sequence of 61-7484 strain FLAV (GenBank Accession: AF523199).

注：1-4分别为登革热病毒血清1-4型，5为西尼罗病毒，6-7分别为乙型脑炎病毒基因1型和3型，8为蜱传脑炎病毒，9为库蚊黄病毒，10为狂犬病病毒，11为Tahyna病毒，12为巴泰病毒，13为盖塔病毒，14为版纳病毒，15为辽宁病毒。

图2 FLAV病毒基因拷贝数定量分析标准曲线

3 讨 论

FLAV全基因组自3′-5′端，依次排列着N、P、U1、U2、U3、M、G、SH和L片段[4]。其中N、P、M、G和L为结构基因，分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和L大蛋白。在GenBank中收录的全部FLAV基因序列中，与结构蛋白相关的寥寥无几，其中最多的为L基因序列，一共2条。本研究选择了相对较为保守的L基因序列进行比对分析，锁定L基因序列中最为保守的区域作为扩增目标片段。全部实验结果表明，所建立的针对FLAV L基因的一步法TaqMan RT-PCR检测方法具有较高的特异性、稳定性和敏感性，并可以达到最低100copies/PCR的检测限值。

表2 FLAV检测体系重复稳定性实验数据

FLAV虽然已被人类发现了50余年，但公开发表的研究性论文却极其有限，至今未能在弹状病毒科内明确分类，且对人类感染所造成的疾病和临床症状均无明确记载。仅从现有资料可知，弹状病毒科除去植物病毒外，引起动物感染的病毒主要包括水泡性病毒属、狂犬病病毒属、短暂热病毒属和粒外弹状病毒属的病毒等。FLAV虽未归至上述各病毒属，但其感染复制特性具有本科病毒的普遍特征。从另一个角度来看，可能正是由于FLAV在人类社会中感染造成的影响及危害相对有限，传播地域也仅限于有报道的布局地区，所以未能得到更多的关注与研究。

FLAV在分离与鉴定时，若采用常规的分离培养方法耗时较长，且对标本质量要求较高，尤其对于病毒载量极低或无活病毒的标本基本无效。本研究所建立的病毒检测方法，是针对FLAV基因组RNA的一步法TaqMan PCR，可直接以FLAV基因组RNA为模板，提取后直接检测并实时观察结果，不仅耗时短，而且不易污染，相对传统方法更加特异、敏感和定性，通过简便的操作就可以对FLAV进行定性和定量。

TaqMan PCR技术是当今应用最为广泛的Real-time PCR方法之一，相对其他的实时荧光定量检测方法具有更高的特异性，其利用特异性荧光探针在PCR过程中所产生的荧光信号，动态收集荧光信号强度，通过荧光强度的变化进行定性和定量分析，具有检测范围广、敏感度高、更为特异，且省时省力、无需电泳、减少污染等特点，适用于标本量较大的流行病学调查和实验室筛查工作[7-9]。本研究建立的FLAV TaqMan PCR检测方法，不仅可用于实验室的临床诊断，还将为今后更加高效的开展FLAV监测及研究工作提供良好的技术支持。

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Establishment of TaqMan RT-PCR assay for Flanders virus

LI Hao1,HE Xiao-xia1,CAO Yu-xi1,NIE Kai1,LIU Yan2,HE Ying1,GAO Xiao-yan1,FU Shi-hong1,WANG Huan-yu1

(1.InstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChinaCDC,Beijing102206,China; 2.HarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China)

The Flanders virus (FLAV) is a number of familyRhabdoviridae, contains a single-stranded, negative-sense viral RNA. Here we describe a molecular detection method developed for fast measurement of FLAV based on Taqman RT-PCR method. In this study, FLAV specific primers and probe were designed based on the FLAV L gene sequences published in GeneBank. Quantitative standard curve of FLAV TaqMan PCR was also successfully established. The specificity and stability test showed that the system is specific and the coefficient variables were all less than 1.7%. Quantitative standard curve based on the genomic copy was drawn, and the lowest detectable limit (LOD) of system was 100 copies/PCR, with higher sensitivity and stability than that of the conventional RT-PCR assay targeting the same gene.

Flanders virus; TaqMan RT-PCR; Molecular detection

Wang Huan-yu, Email:rainoffall@yahoo.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.005

国家科技重大专项项目(No.2013ZX10004-101)(李浩、赫晓霞对本文同等贡献)

王环宇，Email：rainoffall@yahoo.com

1.中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 102206； 2.哈尔滨医科大学，哈尔滨 150086

R373.9

A

1002-2694(2015)03-0212-04

Supported by the National Science and Technology Major Project of the Ministry of Science and Technology of China (No. 2013ZX10004-101)

2014-10-23；

2014-11-27