葛志华 李俊玫 李隆庆 周晓慧 (承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

本文采用D-半乳糖诱发衰老大鼠模型，用原位杂交法检测下颌下腺NGF mRNA、EGF mRNA表达的改变，从基因转录水平探讨衰老对下颌下腺分泌功能的影响及何首乌饮抗下颌下腺衰老的作用机制，为下颌下腺衰老相关疾病的防治奠定理论基础和提供实验数据。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器 VT1000S振荡切片机(德国LEICA公司);Olympus光学显微镜(日本);实验大鼠购自河北省实验动物中心，合格证编号:605106。何首乌饮方剂由炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓组成(本院贾春华教授提供)购自承德富尔康药业有限公司。

1.2 实验动物的选择及分组 选用8周龄清洁级SD雌性大鼠90只，体重180～220 g，随机分为预防性和治疗性两大实验部分，每部分5组，每组9只。

1.3 模型的建立及各组动物的处理方法 预防性实验部分:何首乌饮(HSWY)预防高(Ph)、中(Pm)、低 (Pl)剂量组大鼠腹腔注射D-半乳糖的同时每日分别灌胃HSWY(3.872，1.936，0.968 g/100 g，水煎浓缩成 0.6 ml/100 g)，每天一次，连续60 d。正常组(N)大鼠正常喂60 d。模型组(M)大鼠每日腹腔注射D-半乳糖(300 mg/kg)，连续60 d。治疗性实验部分;何首乌饮治疗高(Th)、中(Tm)、低(Tl)剂量组大鼠腹腔注射D-半乳糖，1次/d，连续 60 d后分别灌胃 HSWY(剂量同上)，1次/d，连续60 d。阴性对照组(NC)大鼠每日按0.5 ml/100 g腹腔注射生理盐水，连续60 d后每日灌胃生理盐水0.6 ml/100 g，连续60 d。自然恢复组(S-R)大鼠腹腔注射D-半乳糖，1次/d，连续60 d后正常喂养60 d。

1.4 原位杂交标本的取材及固定 大鼠经10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉后，开胸，经左心室插管入主动脉，生理盐水冲净血液后4%多聚甲醛灌注、固定，取双侧下颌下腺，4%多聚甲醛后固定过夜。

1.5 原位杂交染色程序 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6～8 μm。石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O21份加蒸馏水10份混合，室温5～10 min灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。暴露mRNA核酸片段，后固定，胃蛋白酶消化后室温固定10 min。蒸馏水洗涤3次。预杂交，杂交，杂交后洗涤，滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60 min。原位杂交 PBS洗5 min×4次。滴加SABC，37℃ 20 min。用 PBS洗5 min×3次。滴加生物素化过氧化物酶，37℃20 min。用PBS洗5 min×4次。DAB显色，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，封片。

1.6 细胞计数 对NGF mRNA、EGF mRNA原位杂交染色的切片，在400倍显微镜下计数阳性细胞。每只动物取3张切片，每一切片随机检查3个视野，计算导管细胞中阳性细胞数。

1.7 统计学方法 采用SPSS11.0软件。计量资料用±s表示，组间比较行单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q检验。

2 结果

2.1 下颌下腺NGF mRNA、EGF mRNA原位杂交结果 反应产物呈浅棕色或深褐色颗粒，杂交信号主要分布于纹状管和颗粒曲管上皮细胞中，其上皮细胞胞质呈阳性，腺泡未见阳性反应，同一导管内不同细胞的反应程度各不相同。见图1。

2.2 预防性实验部分组间NGF mRNA、EGF mRNA表达比较方差分析结果显示，组间NGF mRNA、EGF mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.01)。多重比较结果显示，NGF mRNA、EGF mRNA表达以N组最高，M组最低，各预防组处于中间水平，其中Pm组最高。见表1。

2.3 治疗性实验部分组间NGF mRNA、EGF mRNA表达比较

方差分析结果显示，各组间NGF m、EGF mRNA表达差异有统计学意义(P＜0.01)。多重比较结果显示，NGF mRNA、EGF mRNA表达以NC组最高，S-R组最低，各治疗组处于中间水平，其中Tm最高。见表2。

表1 预防性实验部分大鼠下颌下腺NGF mRNA、EGF mRNA的表达( ± s，n=9)

表1 预防性实验部分大鼠下颌下腺NGF mRNA、EGF mRNA的表达( ± s，n=9)

与M(S-R)组比较:1)P﹤0.05，2)P﹤0.01;下表同

组别 预防组EGF mRNA 预防组NGF mRNA N组 83.44±5.102) 92.22±6.002)M组 32.78±2.82 40.78±7.14 Ph组 70.11±6.552) 73.22±5.382)Pm组 76.00±5.242) 88.33±7.731)Pl组 70.89±6.032) 73.22±6.142)

表2 治疗性实验部分大鼠下颌下腺NGF mRNA、EGF mRNA的表达( ± s，n=9)

表2 治疗性实验部分大鼠下颌下腺NGF mRNA、EGF mRNA的表达( ± s，n=9)

NGF mRNA NC组 82.56±4.592) 86.89±7.222)组别 治疗组EGF mRNA 治疗组S-R组 26.44±3.09 36.44±3.01 Th组 50.11±2.852) 52.44±6.542)Tm组 62.56±6.802) 64.89±4.142)Tl组 46.56±2.742) 48.11±6.752)

图1 各组NGF mRNA、EGF mRNA表达(SP，×400)

3 讨论

何首乌饮可从形态学方面延缓衰老大鼠下颌下腺的衰老改变〔1～3〕，但对其分泌功能是否有影响尚不得而知。近年来，随着原位杂交技术的应用，人们从下颌下腺细胞中发现有NGF mRNA、EGF mRNA等多种生物活性物质的mRNA表达，从基因转录和特异的翻译后加工等环节证明了下颌下腺确实能自身合成这些生物活性物质。培养的胶质瘤细胞、鸡背神经节中的非神经细胞、小鼠脑不同部位的胶质细胞等组织细胞中有少量NGF存在，而在活体组织匀浆中无NGF蛋白表达，提示这些部位虽有NGF基因存在，但是处于关闭状态，不能翻译表达NGF。

NGF和EGF在神经系统的正常发育及功能维持，促进损伤神经的再生与修复，促进上皮细胞增殖调控及细胞衰老方面具有重要作用，其表达的改变可反映下颌下腺的分泌功能状态。NGF、EGF的生物合成在转录或翻译过程中受到多种因素的调节。于辉等〔4〕的研究表明外源性的卵泡刺激素对体外孵育的大鼠下颌下腺的EGF及NGF的分泌产生双向调节作用。有研究报道，外源性的雌二醇、孕酮对大鼠下颌下腺分泌EGF也有一定的作用〔5〕;糖尿病可导致下颌下腺分泌生物活性物质GCT细胞和纹状管的功能下降，EGF和NGF的分泌均减少〔6〕，因此，本文采用原位杂交方法，进一步探讨衰老对大鼠下颌下腺组织中NGF mRNA、EGF mRNA的影响。结果表明，NGF mRNA、EGF mRNA原位杂交反应产物分布于纹状管和颗粒曲管的上皮细胞，随着下颌下腺组织的衰老改变，大鼠下颌下腺NGF、EGF基因的表达也发生改变，NGF mRNA、EGF mRNA杂交信号明显减弱，说明衰老可从基因转录水平降低NGF、EGF的合成。

本研究何首乌饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成，是通过补肾(炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿)，补脾(茯苓)，活血化瘀(丹参)药物而达到补肝肾、兼健脾活血化瘀、延年益寿之功效。本研究中何首乌饮各组NGF mRNA、EGF mRNA杂交信号明显增强，且以预防用药效果最好，说明其能增加NGF mRNA、EGF mRNA的转录，对NGF、EGF基因表达的增强可能发生于转录水平。

1 葛志华，赵淑敏，杨桂梅，等.何首乌饮对D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺超微结构的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(14):1778-80.

2 葛志华，李俊玫，王春艳.何首乌饮对衰老模型大鼠下颌下腺组织结构的影响〔J〕.河北医药，2009;31(19):2532-4.

3 葛志华，高福禄，董福生.何首乌饮对D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺Bcl-2、Bax表达的影响〔J〕.现代口腔医学杂志，2009;23(5):512-4.

4 于 辉，刘桂云，陈 蕾，等.卵泡刺激素对体外孵育大鼠下颌下腺分泌NGF和EGF的影响〔J〕.解剖学报，2008;39(6):927-30.

5 刘晓宁，朱晓东，赵 杰，等.胃腔内促性腺激素释放激素类似物对大鼠消化道胃泌素细胞功能的影响〔J〕.解剖学报，2004;35(2):190-3.

6 杜金凯，王春艳，葛志华.db/db糖尿病小鼠颌下腺内皮细胞生长因子和神经生长因子表达的研究〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(14):1390-1.