师长宏 ,毛峰峰,赵 勇,张 海,张彩琴,白 冰,赵善民

自噬在针对结核分枝杆菌(M.tuberculosis,MTB)的固有免疫应答中起重要作用,通过自噬,入侵的 MTB可被巨噬细胞内吞,在自噬相关基因(autophagy-related genes,Atg)的调控下,来源于高尔基复合体、线粒体等细胞器蛋白成分组成新的膜性结构将MTB包裹,形成自噬体结构[1]。自噬体形成后可与溶酶体融合,并借助于溶酶体酸性环境降解入侵的MTB,从而达到免疫防御的目的[2]。但部分MTB毒株可以在巨噬细胞中长期存活,从而逃避巨噬细胞的免疫杀伤作用,提示可能存在某些免疫逃逸机制。ESA T6和CFP10是结核分枝杆菌重要的毒力因子,参与MTB的致病过程[3]。本研究通过雷帕霉素诱导的自噬模型,观察 ESAT6和CFP10融合蛋白对MTB感染的小鼠巨噬细胞中自噬体形成的影响,探讨该融合蛋白抑制自噬体清除MTB的机理。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI-1640细胞培养液购自于 Gibco公司。RNA提取、RT-PCR试剂盒、RIPA裂解液购自于杭州天根生物科技公司。β-actin抗体和Syber Green实时定量试剂盒由西安舟鼎国公司提供。7H10培养基购自于Becton Dicksion公司。MTB H37Rv菌株由本室保存。纯化的 ESAT6-CFP10融合蛋白、抗atg5多克隆抗体及抗atg8单克隆抗体均由本室制备并保存[4-5]。自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)和自噬抑制剂3-MA由Sigma公司提供。小鼠巨噬细胞系RAW264.7、MTB毒株 H37Rv均由第四军医大学实验动物中心保存。

1.2 自噬体检测 实验分4组,每组设6个复样,分别为自噬诱导组、融合蛋白作用组、自噬抑制组和雷帕霉素组。自噬诱导组:1×105小鼠巨噬细胞培养至对数生长期后,加入50nmol/L的雷帕霉素作用3h,然后按MOI=1∶10比例加入1×108CFU的 H37Rv菌株作用4h,PBS(PH7.4)缓冲液洗脱3次以洗脱未结合的 H37Rv菌株。融和蛋白作用组:25μg/mL的ESAT6-CFP10融合蛋白作用小鼠巨噬细胞3h后,加入50nmol/L的雷帕霉素作用3h后,按 MOI=1∶10比例加入1×108CFU的H37Rv菌株作用4h。自噬抑制组:小鼠巨噬细胞加入自噬抑制剂3-MA(600 mg/L)作用12 h,然后按MOI=1∶10比例加入1×108CFU的 H37Rv菌株作用3 h。雷帕霉素组:小鼠巨噬细胞培养至对数生长期后,加入50nmol/L的雷帕霉素作用3h。上述细胞以0.25%胰酶消化后收集细胞,20%锇酸固定过夜,透射电镜观察自噬体的形成。

1.3 菌落形成单位(CFU)检测 ESAT6-CFP10融合蛋白作用组、自噬诱导组和自噬抑制组小鼠巨噬细胞用0.05%Triton X-100处理后收集,7 000r/min离心,收集沉淀,重悬后1∶107稀释,取 100μL悬液接种于 7H10琼脂培养基,37℃培养21d后进行菌落计数,所有实验组设6个重样。

1.4 实时定量PCR检测atg mRNA表达水平 根据 Gen-Bank报道的 atg基因序列 ,分别设计 atg5、atg7、atg8、atg12特异性引物用于实时定量 PCR检测。atg5上游引物为5’atgacagatgacaaagatg 3’,下游引物为 5’ctcataaccttctgaaagtg 3’;atg7上游引物为 5’atgggggaccctggactgg 3’,下游引物为5’gcagagtcaccattgtag 3’;atg8 上游引物为 5’tcggagaagaccttcaag 3’,下游引物为 5’catgttgacatggtcagg 3’;atg12 上游引物为 5’atgtcggaagattcagagg 3’,下游引物为 5’tttcttggtgtctccgggag 3’。上述各组细胞收集后加入1 mL TRIzol提取细胞总RNA并进行cDNA第一链合成。以cDNA为模板,加入25μL Syber Green进行PCR反应,PCR反应条件为:94℃预变性 2 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 1 min,共进行30个循环。atg mRNA相对定量通过下列公式计算[5]:atg mRNA=2-△ct×100。

1.5 免疫印迹检测atg5、atg8蛋白表达水平 收集细胞以RIPA裂解液提取细胞总蛋白。蛋白定量后进行 SDSPAGE电泳,将预先处理的 PVDF膜与 PAGE胶相贴,在恒压100V条件下转移电泳1h,50g/L脱脂奶封闭后,分别加入1∶50稀释的鼠抗atg5多克隆抗体及atg8单克隆抗体,同时以β-actin作为内参对照,4℃过夜,1g/L Tween-20 PBS洗涤后,加入HRP标记羊抗鼠IgG抗体,37℃放置1h。PBS洗涤后,加入底物液显色。

1.6 统计学分析 实验结果的差异性采用LSD-t检验分析,P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 自噬体检测 雷帕霉素作用小鼠巨噬细胞3h后感染H37Rv毒株,透射电镜下可发现由单层膜组成的自噬囊泡出现,见图1A;同样,雷帕霉素也可直接诱导自噬体形成,见图 1B;当加入 ESAT6-CFP10融合蛋白后,结果见图1C,小鼠巨噬细胞中自噬体形成数目明显减少(P<0.05,与自噬诱导组和雷帕霉素组相比较),达到自噬抑制组相同的水平,见图1D;而相同条件下,未加融和蛋白的对照组小鼠巨噬细胞中自噬体数目无明显变化,见图1A,表明ESAT6-CFP10融合蛋白抑制了小鼠巨噬细胞自噬体的形成。

图1 ESAT6-CFP10融合蛋白对MTB感染的小鼠巨噬细胞自噬体形成的影响A:雷帕霉素诱导感染MTB后巨噬细胞形成的自噬体(自噬诱导组);B:雷帕霉素诱导后巨噬细胞形成的自噬体(雷帕霉素组);C:ESAT6-CFP10融合蛋白作用后巨噬细胞形成的自噬体(融合蛋白作用组);D:3-MA抑制巨噬细胞自噬体形成(自噬抑制组)Fig.1 Effects on the autophagy formation by ESAT6-CFP10 fusion proteinA:Autophay induced by rapamycin after infection with MTB;B:Autophagy induced by rapamycin;C:Autophay inhibited by ESAT6-CFP10 fusion protein.D:Autophay inhibited by 3-MA

2.2 CFU检测 H37Rv菌株感染细胞裂解后,稀释后接种于 7H10培养基,经过 21d培养,计数CFU结果见图 2。ESA T6-CFP10融合蛋白组H37Rv菌株CFU为6.68±0.69,而自噬诱导组组CFU为4.47±0.45,两者相比有统计学意义(P<0.05),而自噬诱导组组的CFU指数最高,为7.13±0.57,结果说明 ESAT6-CFP10融合蛋白作用于巨噬细胞后,干扰了自噬体对胞内感染的 H37Rv菌株的清除作用。

2.3 atg mRNA表达水平 MTB感染后,自噬诱导组中atg5、atg8、atg12表达水平均高于雷帕霉素组,在 ESA T6-CFP10融合蛋白作用下 atg分子mRNA表达均下调,其中尤以atg8分子mRNA表达水平下降最为明显,见图3,与自噬诱导组和雷帕霉素组相比均有显著查差别(P<0.05),达到与自噬抑制组相同的水平。

2.4 atg5、atg8蛋白表达水平 分别以抗atg5多克隆抗体及atg8单克隆抗体与感染细胞总蛋白进行免疫印迹分析,结果如图4所示,ESAT6-CFP10融合蛋白组和自噬抑制组中,无论是atg5蛋白还是atg8蛋白表达水平均明显下降,而自噬诱导组和雷帕霉素组均无显著变化。表明ESA T6-CFP10融合蛋白可能通过影响atg分子蛋白表达水平调控自噬体的形成。

图4 免疫印迹分析atg5和atg8蛋白表达水平1:融合蛋白作用组;2:自噬抑制组;3:雷帕霉素组;4:自噬诱导组Fig.1 Expression of atg5 and atg8 detected by immuno blot1:ESAT6-CFP10 group;2:Autophayinhibited group; 3: Rapamycin group; 4:Autophagy induction group

3 讨 论

越来越多的研究表明,胞内感染病原体可以通过某些机制逃避机体的自噬[6]。例如,MTB可能通过自身分泌的某些蛋白,干扰自噬体与溶酶体的融合,抑制巨噬细胞中的自噬体不被降解。MTB抑制自噬体的形成可能是其免疫逃逸的机制之一。与减毒的疫苗株BCG相比较,MTB毒株能在巨噬细胞中长期存活甚至大量繁殖;而非致病性的MTB在感染巨噬细胞后很快被巨噬细胞杀灭,提示毒力因子参与了对抗机体的防御机制。

我们在前期的实验中已观察到ESAT6-CFP10融合蛋白能够抑制巨噬细胞自噬体的形成[4],但未对巨噬细胞清除MTB毒株的能力进行评价,同时前期使用的自噬细胞模型缺乏雷帕霉素的诱导,在巨噬细胞内形成的自噬较少,缺乏典型性,因此本研究实验设计中,除了MTB毒株感染巨噬细胞外,同时使用了雷帕霉素进行诱导,以期与蛋白干预组形成鲜明的对照,同时在检测指标中增加巨噬细胞中MTB的CFU计数,进一步量化巨噬细胞通过自噬清除MTB的能力。

cf p10和esat6均为 ESAT6/WXG-100超家族成员,仅存在于致病性分枝杆菌中,而在BCG及其它环境分枝杆菌中均缺失。这两个基因受同一个启动子调控,共同转录,分泌至体外形成紧密的1∶1蛋白复合物,在MTB的致病过程中具有重要作用,同时该融合蛋白能特异地与宿主细胞表面受体结合,从而调控宿主细胞免疫应答能力[7]。相对于单个ESAT6或CFP10蛋白来说,融合蛋白可提高这两种蛋白的热力学参数和生物学稳定性。此外,在对该复合物的研究中还发现,CFP10蛋白的羧基端氨基酸残基对于维持 ESAT6的毒力是非常重要的,缺失CFP10蛋白后往往会导致 ESA T6毒力的下降,因此本研究选择SAT6-CFP10融合蛋白作为毒力因子更具代表性。

本研究表明雷帕霉素可诱导小鼠巨噬细胞产生自噬体,当 H37Rv菌株感染巨噬细胞后,透射电镜下可发现大量由单层膜组成的自噬囊泡,细胞中自噬体数目较多,加入 ESAT6-CFP10融合蛋白,可使巨噬细胞中自噬体数目明显减少,表明 ESAT6-CFP10融合蛋白抑制了自噬体的形成。CFU检测发现,自噬体形成后可明显降低小鼠巨噬细胞中的CFU计数,有效清除胞内感染的MTB,进一步说明ESAT6-CFP10融合蛋白可能抑制了自噬的形成,使得胞内感染的MTB具有一定的免疫逃逸功能。在自噬体形成过程中,一些自噬相关基因的表达,如atg5、atg7、atg8、atg12 等 ,对自噬体的形成至关重要,其中atg8分子表达的LC3蛋白是自噬形成的标志物[8]。实时定量PCR检测结果表明自噬形成后atg5、atg8及atg12表达量均上调。当 ESAT6-CFP10融合蛋白作用后,多种atg分子mRNA表达均下调,特别是atg8分子下降最为明显。atg5和atg8两种分子的蛋白表达水平也同时下降,因此,推测在MTB感染过程中 ESAT6-CFP10融合蛋白通过影响atg分子的表达水平,特别是抑制atg8的表达调控自噬体的形成,这可能是 ESAT6-CFP10融合蛋白致病机理之一。

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