顾 雯,金 聪,张 硕,张全福,李建东 ,杭小同 ,王 芹,李 川,梁米芳,李德新

登革病毒(dengue viruses,DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),是一类严重危害人类健康的虫媒病毒。据统计,全世界有超过25亿的人口处于登革病毒的威胁之中,登革病毒感染已经成为严重的世界性公共卫生问题[1]。登革病毒根据抗原性不同分为4个血清型(DENV1～4),不同血清型刺激机体产生无保护性作用的交叉抗体及ADE作用,给疫苗的研制带来了极大的挑战,目前全世界范围内尚无被批准的安全有效的疫苗。

登革病毒为单正链RNA病毒,基因组长约ll kb,含单一开放读码框,依次编码3种结构蛋白(C、prM和 E)和7种非结构蛋白(NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和 NS5)[2]。其中 E蛋白为DENV的主要包膜糖蛋白,是重要的抗原成份,也是登革病毒分型的依据。prM蛋白是M蛋白的前体,是形成病毒颗粒的重要膜蛋白并且有助于 E蛋白结构的稳定,NS1蛋白是登革病毒重要的非结构蛋白。

2009年7月,浙江省义乌市暴发了登革热疫情,经实验室诊断为登革3型病毒感染所致[3]。本研究对2009年登革3型病毒义乌流行株进行E基因及NS1基因的系统进化分析,构建该流行株prM/E基因重组质粒,获得分泌表达的E蛋白并对其免疫原性进行初步研究,为登革病毒诊断抗原的制备及登革疫苗的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株及抗体 293T细胞及BHK-21细胞由美国ATCC引进;DENV-3义乌分离株由浙江省疾控中心惠赠;DENV1-4型国际标准株(DENV-1 Hawaii株,DENV-2 NGC株,DENV-3 H87株及DENV-4 H241株)由本室保存。FITC标记的抗兔IgG抗体购自Sigma公司;HRP标记的抗兔IgG抗体购自Snata Cruz公司;DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清、DENV 1-4 EIII蛋白(分别表达DENV1-4国际标准株的EⅢ蛋白)由本室制备。

1.2 序列测定及系统进化分析 病毒RNA提取采用德国Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini kit,逆转录为cDNA后利用设计的28对引物扩增全基因组相应区段,序列测定后经拼接获得全基因组序列。利用MEGA4将其与 GenBank中检索到的其它14株登革3型病毒进行E及NS1区段核苷酸及氨基酸序列比对和同源性分析,Neighbor-joining(NJ)法建立系统发生树,并用Bootstrap值为1 000评价系统发生树。

1.3 E蛋白的分泌表达 设计引物扩增DENV-3义乌分离株prM/E基因,通过融合 PCR方法在prM基因前添加一段来源于乙脑病毒的信号肽序列并将E基因C端的20%区域替换为乙脑病毒相应序列。基因片段经N heI、NotI双酶切后克隆至pcDNA5/FRT载体中,重组质粒命名为J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5。利用罗氏公司 Fu-GENE HD Transfection Reagent转染试剂将该质粒转染293T细胞,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48 h后收集上清。IFA及Western Blot方法分别检测E蛋白在胞内的表达及胞外的分泌情况,以DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清(1∶200稀释)及登革病人血清(1∶50稀释)为一抗,FITC标记的抗兔IgG(1∶100稀释)或 HRP标记的羊抗兔 IgG抗体 (1∶3 000稀释)为二抗,按常规 IFA及 Western Blot操作步骤进行检测。

1.4 分泌性E蛋白的免疫原性研究

1.4.1 BALB/c小鼠免疫实验 将 4-6w龄BALB/c雌性小鼠(由中国协和医科大学实验动物研究所提供)随机分为 2组(5只/组),即实验组(DENV-3 YW E蛋白组)及对照组(PBS组)。蔗糖密度梯度离心纯化后的DENV-3 E蛋白及PBS分别与等体积的弗氏佐剂(初次免疫为弗氏完全佐剂,加强免疫为弗氏不完全佐剂)充分乳化后于第0、14、28d进行腹腔接种,免疫剂量为 100μg/只。末次免疫两周后小鼠摘除眼球取血,分离血清备用。

1.4.2 ELISA检测血清抗DENV 1-4 EIII蛋白抗体 以原核表达纯化的DENV 1-4型EⅢ蛋白为抗原包被酶标板。每只小鼠血清从1∶50起作2倍系列稀释,37℃孵育1h。加入1∶1 000稀释的 HRP标记抗鼠IgG,37℃1h,显色并终止。酶标仪检测吸光度A450值。以PBS组各稀释度A450值为阴性对照,根据Cutoff为 P/N>2.1的标准,选择符合该标准的最大稀释度作为每份血清的滴度并进行对数转换。

1.4.3 微量细胞病变中和试验检测血清中和活性将BHK-21细胞传代至96孔板,待细胞长至单层。将灭活后的血清从1∶5起作2倍系列稀释,分别与100TCID50的DENV1-4病毒国际标准株按1∶1混合,37℃温育1h后加入细胞表面,每个稀释度作4个复孔。37℃,5%CO2培养,7d后观察细胞病变。以4个复孔均不出现可观察到的细胞病变的血清稀释度作为抗体中和效价。

2 结 果

2.1 DENV-3义乌分离株全基因组序列测定及系统进化分析 登革3型病毒义乌分离株基因组全长共10,685nt,含单一的开放读码框(95-10 267 nt),共编码3391个氨基酸。利用登革病毒主要结构蛋白E及非结构蛋白NS1的核苷酸和氨基酸序列分别建树,结果见图1。义乌分离株属于登革3型病毒亚型 Ⅲ,与 2009年广州 GZ1D3株 (GB:GU363549)相似度最高,E基因、NS1基因核苷酸同源性分别为99.7%、99.4%,氨基酸同源性分别为99.8%、99.1%;与 2003年印度 GWL-25株(GB:A Y770511)E基因、NS1基因核苷酸同源性分别为 98.8%、98.5%,氨基酸同源性分别为99.8%、99.1%。与同分为亚型Ⅰ的国际标准株H87株及中国80-2株核苷酸差异大于5%,氨基酸差异为3%。

2.2 DENV-3义乌分离株 E蛋白的分泌表达J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5转染293T细胞后,利用IFA检测胞内表达情况,结果如图2所示,分别以DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清及登革病人血清为一抗,胞内均可检测到荧光颗粒,同时转染pcDNA5/FRT载体的细胞中未见荧光,说明DENV-3 E蛋白在293T细胞内得到特异表达。利用Western blot检测E蛋白在上清中的分泌情况,结果如图3所示,分别以DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清及登革病人血清为一抗,J ESS-ywD3prM/E397 J EV-pcDNA5转染上清在60kD处均可见明显E蛋白目的条带,同时转染pcDNA5/FRT载体的上清中未见目的蛋白的分泌表达。

图1 登革3型病毒系统发生树A:E基因核苷酸序列系统发生树;B:E蛋白氨基酸序列系统发生树;C:NS1基因核苷酸序列系统发生树;D:NS1蛋白氨基酸序列系统发生树Fig.1 DENV-3 phylogenetic treesA:Phylogenetic tree based on E nucleotide sequences;B:Phylogenetic tree based on E amino acid sequences;C:Phylogenetic tree based on NS1 nucleotide sequences;D:Phylogenetic tree based on NS1 amino acid sequences

图2 IFA检测重组质粒在293T细胞中的表达A,C:J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5转染 293T细胞;B,D:pcDNA5/FRT载体转染293T细胞;A,B:DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清为抗体检测;C,D:登革病人血清为抗体检测Fig.2 Immunofluorescence assay of E protein expression in 293T cellA,C:293T cells transfected with J ESS-ywD3prM/E-pcDNA5;B,D:293T cells transfected with pcDNA5/FRT;A,B:E protein detected by DENV-3 EⅢrabbit immune serum;C,D:E protein detected by dengue patient serum

图3 Western Blot检测 E蛋白分泌表达M:蛋白预染Marker;A:阴性对照;B:DENV-3 EⅢ蛋白兔免疫血清为抗体检测J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5转染上清;C:登革病人血清血清为抗体检测J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5转染上清Fig.3 Western blot analysis of extracellular E proteinM:PageRuler Prestained Protein Ladder;A:Negative control;B:J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5 transfection supernatants detected by DENV-3 EⅢrabbit immune serum;C:J ESS-ywD3prM/E397J EV-pcDNA5 transfection supernatants detected by dengue patient serum

2.3 DENV-3义乌分离株分泌性E蛋白的免疫原性测定 纯化的DENV-3义乌分离株分泌性 E蛋白免疫小鼠后运用 ELISA方法检测抗四个型别登革病毒 EIII蛋白的 IgG抗体滴度,结果如图4所示。分泌性E蛋白刺激小鼠产生的抗体可以分别与四个型别登革病毒的 EIII蛋白反应,其中针对DENV-3 EIII蛋白抗体滴度可达1∶1 400,与抗其他三个型别EIII蛋白的抗体水平有显著性差异(P<0.05)。其余各组间均无统计学差异。微量细胞病变中和试验检结果如表1所示,DENV-3义乌分离株分泌性E蛋白能够诱导小鼠产生一定水平的抗登革3型病毒的中和抗体,中和滴度明显高于PBS对照组(P<0.05),但DENV-3义乌分离株分泌性E蛋白诱导小鼠产生的抗体并不能有效的中和其他3个型别的登革病毒。

3 讨 论

图4 ELISA检测小鼠血清IgG抗体滴度＊表示该组与其他各组均存在统计学差异Fig.4 Mouse serum IgGantibody titer identified by ELISA＊Indicates significant differences with other groups

表1 免疫小鼠血清中和抗体检测Table1 Neutralizing antibody titers of immunized mice

本研究利用分子流行病学方法,对2009年9月浙江省义乌市暴发流行的登革毒株进行系统进化分析,结果显示该株病毒属于登革3型病毒亚型Ⅲ[4],且与广州2009年流行株同源性最高,提示浙江省义乌市所流行的登革3型病毒可能与广州 GZ1D3来自于同一进化源头,此源头可能为2003年印度流行的GWL-25株。考虑此次义乌登革病毒流行的毒株可能来源于印度,从而引起2009年广州和浙江义乌的登革3型病毒的流行。真正的输入性流行情况有待进一步的流行病学资料加以证实。

E蛋白是黄病毒属病毒重要的结构蛋白,能够诱导机体产生保护性体液免疫和细胞免疫反应。E蛋白的表达研究有利于病毒诊断及疫苗研究的发展。中和抗体是抵抗登革病毒感染的关键,自然状态下感染登革病毒会产生较高滴度的抗同型病毒的中和抗体,同时产生具有与其他三个血清型存在交叉反应的但无中和活性的抗体[5]。本研究通过对登革3型病毒义乌分离株prM/E基因进行改造,在哺乳动物细胞中获得了分泌表达的 E蛋白,可与登革病人血清发生特异性免疫反应。将 E蛋白免疫BALB/c小鼠并测定其诱导的体液免疫反应,结果显示登革3型病毒分泌性 E蛋白可刺激小鼠产生针对DENV1-4 EIII蛋白的IgG抗体,但仅与登革3型病毒具有中和活性。该研究结果为登革诊断抗原的制备及登革疫苗的研究奠定了基础。

[1]Gubler DJ.Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health,social and economic problem in the 21st century[J].Trends in Microbiology,2002,10(2):100-103.

[2]Henchal EA,Putnak JR.The dengue viruses[J].Clin Microbiol Rev,1990,3(4):376-396.

[3]Sun JM,Lin J F,Yan J Y,et al.Dengue Virus Serotype 3 Subtype III,Zhejiang Province,China[J].Emerging Infectious Diseases,2011,17(2):321-323.

[4]Amarilla AA,Almeida F,Jorge DM,et al.Genetic diversity of the E Protein of Dengue Type 3 Virus[J].Virology Journal,2009,6:113-126.

[5]Murrell S,Wu SC,Butler M.Review of dengue virus and the development of a vaccine[J].Biotechnology Advances,2011,29(2):239-247.