韩倩 尤欣 郭思桃 姜瑞丽 钱雪桥 王永强 刘佳旭

摘要 为了解广东省四会地区某鸡场多病因气囊炎的主要致病菌及其耐药情况。采用形态学鉴定、16S rRNA基因测序等方法对分离株进行鉴定，选取3种常用抗生素进行药物敏感性试验，进行耐药性研究。结果表明：第1株分离株菌落呈典型的“荷包蛋”状，第2株分离株为革兰氏阴性杆菌，第3株分离株为革兰氏阳性球菌，经16S rRNA 基因测序比对分析，3种病原的同源性均在99%以上，确定多病因气囊炎的主要致病菌为鸡毒支原体、大肠埃希氏杆菌和金黄色葡萄球菌，分别命名为SH-MG株、SH-E株和SH-S株。药物敏感性结果表明，SH-E株对阿莫西林、氟苯尼考和泰妙菌素产生了耐药性，SH-S株对阿莫西林产生了耐药性，SH-MG株对泰妙菌素敏感。说明禽多病因气囊炎很可能是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鸡毒支原体共同感染造成的，其中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对一些常用的抗生素表现出耐药性，泰妙菌素是防治鸡毒支原体感染的首选药物。

关键词 禽多病因气囊炎；分离鉴定；耐药性；鸡毒支原体；禽致病性大肠杆菌；金黄色葡萄球菌

中图分类号 S858.31  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）11-0085-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.018

Isolation， Identification and Antibiotic Resistance of Pathogen Isolated from Avian with Multicausal Airsacculitis

HAN Qian，YOU Xin，GUO Si-tao et al

（Guangdong HAID Group Co.Ltd.， Key Laboratory of Microecological Resources and Utilization in Breeding Industry， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Guangzhou， Guangdong 511400）

Abstract In order to investigate the major pathogen of multicausal airsacculitis and its antibiotic resistance in a hennery in Sihui area of Guangdong Province， the morphological identification， 16S rRNA gene sequencing were performed， and drug resistance of these isolates were assessed using MIC. The results showed that the colonies of the first isolate had a typical “poached egg”shape， the second isolate was Gram-negative bacilli and the third isolate was Gram-positive cocci. 16S rRNA gene sequencing analysis results showed that the isolated strains were identified as Mycoplasma gallinarum， Escherichia coli and Staphylococcus aureus， named as SH-MG strain， SH-E strain and SH-S strain， respectively. Drug resistance results showed that SH-E strain was resistant to amoxicillin， florfenicol and tiamulin， and SH-S strain was resistant to amoxicillin. We conclude that the multicausal airsacculitis is probably caused by co-infection of drug-resistant Staphylococcus aureus， drug-resistant Escherichia coli and Mycoplasma gallinarum， tiamulin is the first choice for the prevention and treatment of mycoplasma gallinis infection.

Key words Multicausal airsacculitis;Isolation and identification;Drug resistance;Mycoplasma gallisepticum;Avian pathogenic Escherichia coli;Staphylococcus aureus

基金项目 广州市高水平企业研究院项目（202205110006）。

作者简介 韩倩（1993—），女，江苏徐州人，硕士，从事动物行为与健康养殖研究。

*通信作者，兽医师，博士，从事动物传染病和免疫学研究。

收稿日期 2023-08-03；修回日期 2023-08-24

禽呼吸道疾病长期困扰着养禽业，春秋季节高发，严重影响了鸡群增重、生长发育和产蛋率，对养禽业造成了的巨大经济损失［1］。2021年以来，广东省四会地区某鸡场陆续出现气囊纤维素性渗出、气管栓塞等多病因气囊炎的症状，发病率为50%～70%，死亡率高达30%。据报道，鸡毒支原体（mycoplasma gallisepticum，MG）是引发鸡的慢性呼吸道疾病的主要病原之一，常与禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、传染性鼻炎、新城疫和传染性支气管炎等混合感染［2］，可导致呼吸道症状加重，死亡率升高。此外，由于基层养殖场对抗菌药物的长期依赖和不合理用药，导致多种细菌的耐药性呈逐年上升趋势［3］。鉴于此，为了确定该鸡场雏鸡气囊炎的发生是否由MG、APEC和SA联合感染，在进行现场流行病学观察及临床诊断基础上，无菌采集1～2月龄发病雏鸡的咽拭子，进行了病原的分离鉴定及药物敏感性试验。不但可以为控制该病的发生提供理论支持，而且可以为动物感染疾病模型的建立提供依据，对禽类健康养殖及畜牧业的可持续发展具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料与菌株来源。

20份咽拭子，采自广东省四会地区某鸡场；鸡毒支原体标准菌株S6株，由华南农业大学丁焕中教授赠予；禽致病性大肠杆菌10389标准株及金黄色葡萄球菌10384标准株，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 主要试剂及设备。

1.1.2.1 主要试剂。革兰氏染色液（环凯微生物公司，批号6107243）、麦康凯琼脂（环凯微生物公司，批号022140）、甘露醇高盐琼脂（海博生物，批号HB4128）、麦氏比浊管（环凯微生物公司，批号075870）、PPLO无结晶紫肉汤（海博生物，批号HB8475）、LB肉汤培养基（广东环凯微生物，028320）、胎牛血清（美国 Gibco 公司，批号10091148）、酵母菌（安琪酵母股份有限公司）、醋酸铊（美国 Sigma 公司，批号T8266-5G）、PCR Master Mix（购自TakaLa公司，批号RR300A）、阿莫西林、氟苯尼考和延胡索酸泰妙菌素标准品（国家标准品网，批号CCAD300574、140806和Y0000333）。

1.1.2.2

主要仪器。二氧化碳培养箱（ESCO公司，CLM-170B-8-NF型）、振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司，ZQZY-AF8V型）、生物安全柜（ESCO公司，AC2-4D1型）、电泳凝胶成像系统（SAGECREATION公司，Champ Ge17000型）、正置显微镜（LEICA，DM750型）。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集与初步分离。

1.2.1.1

鸡毒支原体的分离与纯化。随机无菌采集10份患有气囊炎病鸡的咽拭子，编号后立即放入加有2 mL PPLO培养基［1］的10 mL EP管内，使用0.45 μm滤器过滤2次，垂直放置于37 ℃，5% CO2培养箱恒温培养3～6 d，直到培养基的颜色呈现黄色后再传代。连续传代7～9次后，取培养物接种固体培养基，5% CO2，37 ℃培养6～7 d。在低倍镜下选取单个菌落再次接种PPLO肉汤培养基，5% CO2，37 ℃培养至培养基颜色刚好变黄后，得到纯化的分离株培养物［4-5］。

1.2.1.2

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的分离与纯化。无菌采集10份咽拭子病料接种于LB 肉汤培养基中，于37 ℃振荡培养箱中过夜培养，再用无菌接种环蘸取少量培养液分别在麦康凯、甘露醇高盐选择培养基上划线接种，于37 ℃恒温培养箱中培养 24 h。挑取可疑单菌落接种于 LB培养基中，置于37 ℃ 180 r/min振荡培养箱中过夜培养，重复3次，得到纯化的分离株培养物。

1.2.2 菌落形态及染色鉴定。

显微镜低倍镜下直接观察PPLO固体培养基上的MG菌落形态，在这之后使用Dinese染色液染色后再次置于显微镜低倍镜下观察形态。分别吸取5 μL APEC和SA菌液沉淀均匀涂于载玻片上，按照革兰氏染色液试剂盒说明书染色，油镜下观察菌体形态。

1.2.3 病原的PCR鉴定。

根据NCBI中MG、APEC和SA的16S rRNA序列设计引物，分别以菌液为模板，进行PCR鉴定。引物序列如表1所示，引物由上海生工合成。

对疑似菌液采用 10 μL 的反应体系进行PCR扩增：上、下游引物各0.2 μL，模板1.0 μL，Mix 5.0 μL，无菌水3.6 μL。同时用鸡毒支原体标准菌株S6株、禽致病性大肠杆菌10389标准株及金黄色葡萄球菌10384标准株做阳性对照，并设立无菌水为模板做阴性对照。反应条件：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性15 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃后延伸5 min。扩增产物取 6 μL 经1 %的琼脂糖凝胶进行电泳，使用1×TAE 缓冲液，180 V 恒压电泳 35 min，电泳后将凝胶置于凝胶成像系统拍照保存后弃去。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定。

取一96孔板，每孔加入200 μL PPLO（或50 μL MH）培养基。向每排第1孔加入50 μL抗生素，抗生素溶液配制方法见表2。用移液器吹打3～5次混匀后，吸取50 μL混合液加入第2孔，混匀后，吸取50 μL混合液加入第3孔，以此类推，至第10孔时，吸弃50 μL混合液。向每排前11孔中加入50 μL菌液，使其终浓度为2×104 CCU/mL（5×105 CFU /mL）。加盖后用封口膜封住周围的缝隙以防漏气，5% CO2，37 ℃（或37 ℃）培养4～6 d（或过夜培养），每日观察记录结果，当变色孔不再增加后确定终点，并以抑制MG（或APEC和SA）生长的抗生素的最高稀释度作为最低抑菌浓度。

3种抗生素对分离菌株的药敏折点如表3 所示。相关数据来自美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）。

2 结果与分析

2.1 鸡毒支原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的分离及初步鉴定结果

成功从广州四会某鸡场的临床样本中分离得到一株鸡毒支原体，命名为SH-MG株；一株大肠杆菌，命名为SH-E株；一株金黄色葡萄球菌，命名为SH-S株。将样品处理后接种于PPLO液体培养基，37 ℃，5% CO2 恒温箱培养7～9代，随后接种于PPLO固体培养基，37 ℃，5% CO2 温箱培养3～7 d，在显微镜观察到圆形并呈典型“荷包蛋” 样的菌落（图1A）。使用Dinese染色后，低倍镜下同样观察到典型的“煎蛋型”菌落（图1B）。挑取单菌落到PPLO液体培养基中进行培养，待发生颜色改变后再次接种PPLO固体培养基，重复3次，即可获得纯化的支原体，CCU 测定结果为 109 CCU/mL。将SH-E和SH-S样品分别划线接种于麦康凯（图1C）和高盐甘露醇固体培养基（图1D），于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，挑取单菌落涂片、革兰氏染色镜检（图1E、图1F），筛选疑似菌落，4 ℃保存备用。

2.2 鸡毒支原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的PCR鉴定结果

分离株16S rRNA 基因 PCR 鉴定结果显示，扩增片段的大小分别为 538、358和607 bp（图2），与预期片段大小相符，表明片段扩增正确。对16S rRNA 基因测序结果进行 Blast 基因比对分析，结果表明，扩增序列与 NCBI上公布的16S rRNA序列NR_104952.1、NR_024570、NR_118997同源性均在99%以上。证实该分离株为鸡毒支原体、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

2.3 鸡毒支原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的耐药性分析结果

药物敏感试验结果见表4。由表4可知，与大肠杆菌10389标准株相比，SH-E株对氟苯尼考和泰妙菌素产生了较强的耐药性，MIC值相差数10倍；与金黄色葡萄球菌10384标准株相比，SH-S株对阿莫西林和泰妙菌素产生了较强的耐药性，MIC值相差数百倍。鸡毒支原体S6株和SH-MG株对3种抗生素的药物敏感性一致。

3 讨论

在该试验中，试验所用病料为广东省四会地区发病雏鸡的咽拭子，雏鸡表现为气管栓塞、气囊炎等多病因气囊炎的症状。由于不同病原菌的致病性和耐药情况不同，所以对病原的鉴定显得尤为重要。结合传统分离鉴定方法与PCR技术，发现多病因气囊炎很可能是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鸡毒支原体混合感染造成的，而且大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对阿莫西林和氟苯尼考表现出耐药性，鸡毒支原体对泰妙菌素敏感。

支原体分离、培养条件比较苛刻，生长缓慢，培养时间长，操作繁杂［7］。结合该次试验，对该技术的几个关键点进行总结。此次试验10份咽拭子中仅有1份分离出1株MG，分离率低至10%，因此建议采集病料时数量加倍，或采集杂菌少、易分离出支原体的新鲜支气管和肺组织［8］。据文献［4-5］报道，病料培养液的过滤除菌可采用0.22 μm或0.45 μm滤膜，但经过多次尝试后发现0.22 μm滤膜过滤后，滤液中通过PCR方法无法检测到鸡毒支原体，仅能在0.45 μm滤膜过滤后的菌液中分离出鸡毒支原体，因此建议滤器采用0.45 μm孔径大小。在分离过程中，发现大部分杂菌耐药性很强，且0.45 μm滤膜难以过滤掉所有杂菌，可通过增加醋酸铊、青霉素的用量或增加传代次数来提高分离支原体的成功率，该次试验发现传至7代左右，菌液由浑浊变为透明的橙黄色液体，此时再通过涂布方法便可分离出支原体单菌落。此外，支原体的培养对营养条件要求高，采购血清时须选取品质高、有保障的品牌。

近年来，随着养禽业越来越规模化、集约化，多种病原的混合感染，特别是一些饲料添加剂中盲目使用某些抗菌药物，导致细菌的耐药性呈逐年上升趋势［9］。这不仅不能达到理想的治疗效果，反而更易引起动物体内正常菌群失调，导致耐药性的产生［10］。该试验结果表明，与大肠杆菌10389标准株和金黄色葡萄球菌10384标准株相比，导致多病因气囊炎的大肠杆菌SH-E株和金黄色葡萄球菌SH-S株对常用的抗生素均产生了较强的耐药性。因此，在临床上，要了解地区流行野毒株的种类和药物敏感性，合理使用抗菌药物，从而减缓细菌耐药性的发生。

目前，药物预防仍是国内控制鸡毒支原体感染的常用方法，其中应用最广泛的药物是延胡索酸泰妙菌素［11］。隋兆峰等［12］2013—2015年的鸡毒支原体临床分离株体外敏感性试验表明，其耐药性变化不大且敏感性高［12］，该研究也证实了这一点。在临床治疗过程中难以依靠药敏试验结果选择药物的种类及用量，基本依据经验治疗，从而导致很多临床常用药对病原逐渐产生耐药性。因此，对病原进行分离、鉴定及耐药性监测有重要的意义，应根据检测结果选择对该病敏感的药物进行治疗。根据该研究结果，估测延胡索酸泰妙菌素未来几年仍是防治鸡毒支原体的首选药物。

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