曹登慧

摘要：试验通过细菌分离培养及分子生物学诊断技术对一起引起奶牛关节炎的病原进行了鉴定。结果显示，该病原菌落形态为“油煎蛋样”，牛支原体16S rRNA和uvrC均扩增出相应的片段，且16S rRNA和uvrC基因序列构建的系统发育树与牛支原体在同一分枝。说明引起该奶牛关节炎的病原菌为牛支原体。

关键词：牛支原体；关节炎；分离鉴定

中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2016）09-0011-02

牛支原体（Mycoplasma bovis）是一种能够引起牛发生肺炎、乳房炎、关节炎、角膜结膜炎、怀孕母牛流产、不孕、生殖道感染等的疾病[1]，在环境等应激因素的作用下还可引起多种疾病的继发感染。1961年Hale等[2]在美国首次从患乳腺炎的牛乳中分离到该病原，1976年首次报道与牛呼吸系统疾病有关。目前，该牛支原体病原在世界范围内广泛流行，并对各国的养牛行业造成巨大的经济损失，严重影响和制约了各国养牛业的发展[3]。1983年，我国黎济申首次报道从乳房炎牛乳中分离到牛支原体。自2008年以来，我国部分地区从外地引进的肉牛暴发了以坏死性肺炎为主要特征的传染性牛支原体肺炎疫情，发病率为50%～100%，病死率高达10%～50%，给我国养牛业造成了巨大的经济损失[4]，此后重庆、内蒙、贵州、宁夏等多省报道了肉牛和奶牛发生了牛支原体病[5，6]，因此牛支原体在牛养殖过程中也成为危害性较大的病原体之一，但国内很少有关于牛支原体感染成年母牛引起关节肿大的报道。

2015年12月，宁夏某奶牛场出现成年奶牛关节肿大症状，患病母牛是从甘肃地区新采购的泌乳母牛，购买时均未发现其有关节肿大症状，于购回后一周出现四肢关节肿大现象，虽用抗生素进行治疗，但未能治愈。该成年母牛除关节肿大外未表现出咳嗽、肺部听诊呈湿啰音等症状。为确定引起该牛关节肿大的病原体，在无菌条件下采取成年奶牛关节积液若干份进行了病原的分离培养及鉴定。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

1.1.1 病料 无菌采集的宁夏某牛场关节肿大奶牛的关节液。

1.1.2 主要试剂及设备 主要试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒（DP209-02），琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP302-02），天根生化科技有限公司；D2500-50Omega-琼脂糖凝胶回收试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。主要仪器：CO2培养箱、PCR扩增仪、电泳凝胶成像系统等。

1.2 方法

将关节液接种于改良的Thiaucourt's液体培养基中。置于37 ℃恒温振荡培养箱中培养2 d，2 d后观察培养基的颜色，将变为黄色的培养液使用0.22 μm滤膜进行过滤，重复培养过滤液2 d后接种于牛支原体Thiaucourt's 固体筛选培养基，置于5% CO2培养箱中37 ℃条件下培养2～4 d，固体培养基由红色变为黄色并且出现针尖大小密集的菌落，在光学显微镜下观察菌落形态。

1.3 特异性PCR鉴定

1.3.1 菌体收集 吸取2 mL牛支原体液体培养物于2 mL灭菌离心管中，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，后弃上清，用灭菌滤纸片吸干离心管管壁上的上清液，向灭菌离心管中加入2.2 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）将菌体沉淀悬浮，于4 ℃ 12 000 r/min再次离心30 min后弃上清。同样用灭菌滤纸吸干多余液体后加入250 μL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2），转到1.5 mL灭菌离心管中保存备用。

1.3.2 基因组DNA的提取 具体方法按试剂盒说明书中的方法进行。

1.3.3 PCR引物的合成 根据GenBank中牛支原体的全基因序列，分别设计支原体16S rRNA通用引物P1：上游引物5′-GAATTCCGAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，下游引物：5′-AAGCTTGAGGTAATCCATCCCCACGTTC-3′；牛支原体uvrC特异性引物P2：上游引物：5′-GAATTCAATGTGTCTACTAGTCCTGG-3′，下游引物：5′-AAGCTTAGCGTCATAGATTTTTGCATA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.4 PCR反应 25 μL PCR反应体系：模板2 μL，P1、P2引物各0.5 μL，Mix 10 μL，dd H2O 12 μL，共计25 μL。

16S rRNA引物PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35个循环。72 ℃延伸8 min。

UvrC引物PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，35个循环。72 ℃延伸8 min。

将经过扩增的DNA产物通过琼脂糖凝胶电泳试验进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 病牛临床症状

患病奶牛主要表现为四肢关节肿大（图1），未表现出咳嗽、肺部听诊湿啰音、体温升高等症状。该牛用头孢、青霉素、链霉素、卡那霉素等抗生素治疗效果不明显，并且该牛关节液浑浊。

2.2 病原的分离

将关节液接种于Thiaucourt's液体培养基置于37 ℃恒温振荡培养箱中培养，2 d后用0.22 μm过滤器进行过滤，继续培养过滤液2 d后，培养基由红色变为黄色且澄清透明，无沉淀。取10 μL液体培养液接种于固体培养基于5% CO2培养箱37 ℃培养2 d，长出针尖大小菌落，显微镜下呈现牛支原体典型的“油煎蛋”样菌落（图2、图3）。

2.3 PCR鉴定

由图4和图5可知，经16S rRNA引物和uvrC引物PCR扩增关节液培养物和牛支原体阳性对照，并通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果发现，引起牛只关节肿大的病原菌的16S rRNA扩增序列长度约1.5 kb左右，uvrC扩增序列长度约1.6 kb，与阳性对照一致。根据PCR结果可初步鉴定该病原微生物为牛支原体。

2.4 遗传进化分析

经测序并构建遗传进化树分析可知，16S rRNA序列构建的系统发育树结果表明，GJY与已报道的牛支原体120/81菌株遗传距离最近，自检支持率达75%（图6）；uvrC序列同源性比较结果显示，GJY与GenBank中的牛支原体Egy-11-DK-14、HB0801-P150株同源性最高。构建的系统发育树结果表明，GJY与已报道的牛支原体Egy-11-DK-14、HB0801-P150遗传距离最近，与Egy-11-DK-14自检支持率达86%（图7）。根据遗传进化树结果最终可以确定引起此次奶牛关节炎的病原菌为牛支原体。

3 讨论

牛支原体是柔膜体纲支原体目支原体科支原体属的一员，无细胞壁，具有典型的“油煎蛋”样菌落形态。当气候条件、饲养环境及饲料配方发生改变时，牛体抵抗力下降，就有可能引发牛支原体病的发生。随着我国养牛产业的快速发展，牛群的调运必然是促进规模化养殖的关键，然而不同地区之间的牛群调运必然会使病原菌快速传播扩散，牛支原体传播扩散的风险也将提高，因此应引起各级兽医部门的重视，提高对牛支原体肺炎的认识，加强对该病的防控措施[7，8]。分析本次引起牛支原体肺炎关节肿大的主要原因是该牛场在引进牛只时牛群管理不到位及平时牛群饲养管理中存在着欠缺，在引进牛只时未进行牛支原体普查，致使带菌牛被购进，购进的牛又由于长途运输产生了应激，进而免疫力降低。由于目前对于牛支原体病原没有很好的治疗药物，所以建议牛场进行牛支原体普查，制定科学合理的防治方案，降低牛支原体给规模化养殖带来的风险，做好牛场管控，防止牛支原体在各牧场间传染。

目前牛支原体的分离培养与分子生物学鉴定可作为该病原体的确诊依据，特别是使用牛支原体uvrC特异性引物进行鉴定，可有效区分无乳支原体等病原的混淆。本试验通过病料采集、实验室分离鉴定，结合分子生物学鉴定，遗传进化分析，最终确诊引起该奶牛场成年母牛关节肿大的病原为牛支原体，为牛支原体引起的肺炎和关节肿大等疾病的实验室诊断及病原的分析奠定了一定基础。

参考文献：

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[3] KUMAR A，VERMA A K，RAHAL A. Mycoplasma bovis，A multi disease producing pathogen：An overview[J]. Asian J Anim Vet Adv，2011，6（6）：537-546.

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