农耀斌 黄鸿娜 黄晶晶 毛德文 杜沅沁 宋文选 朱荣火 徐 健

1.贵港市人民医院 (广西 贵港, 537100) 2.广西中医药大学第一附属医院 3.广西中医药大学第一附属医院仙葫院区脾胃肝病科

慢性肝病(CLD)在全球范围内发病率持续上升,每年大约有200万人死于肝硬变和肝癌[1]。尽管肝可以分化并增殖肝细胞、肝上皮细胞、胆管上皮细胞,具有修复肝脏损伤的能力,但肝脏的反复损伤会耗尽肝脏的再生能力,使纤维化进展为肝硬变,严重者发展为肝癌。当前预防及逆转慢性肝病的治疗手段有限。因此,研究CLD的有效治疗是目前临床上的迫切需求。Hippo信号通路可抑制导致肝脏显著过度生长表型,在调节肝脏发育、再生,癌症以及免疫系统等方面发挥着重要作用[2,3]。本文论述Hippo信号通路在肝脏中的作用及对CLD新疗法的潜在价值。

1 经典Hippo信号通路

经典Hippo信号通路首先在果蝇中发现,而相应的哺乳动物丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶Hippo缺失导致过度生长表型[4]。丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶MST1和MST2与支架蛋白萨尔瓦多同源1形成复合体。MST1和MST2磷酸化并激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶LATS1和LATS2[5]。在多种丝氨酸残基15上磷酸化YES相关蛋白1(Y AP),包括人类蛋白中的S127或小鼠蛋白中的S112。带有PDZ结合基序的转录共激活因子(TAZ)也被该复合体磷酸化,TAZ是YAP的类似物[6]。YAP-TAZ的磷酸化导致支架蛋白14-3-3与细胞质结合并将其隔离在细胞质中,最终通过F-box/WD重复序列包含蛋白1A将其作为蛋白酶体降解的靶点。当YAP和TAZ被低磷酸化时,它们可以移位到细胞核并与转录因子TEAD家族相互作用,介导靶基因的表达[7]。因此,典型的Hippo信号通路起着抑制YAP-TAZ活性的作用。

2 Hippo信号通路上游调控

2.1 细胞的极性和黏附性 Hippo信号通路的一个主要功能是限制细胞的增殖。Hippo信号调节部分是由参与连接形成细胞极性的蛋白质复合体介导的也可通过黏附性传递。有学者研究发现,在多种类型的高密度上皮细胞中组装紧密连接相关的Crumbs复合体可以增加YAP-TAZ的磷酸化,导致它们的细胞质隔离。肿瘤抑制因子肝激酶B1(LKB1)通过激活蛋白酶激活的受体蛋白(TAZ、LATS、MST),促进Scribble膜复合体,从而激活肝脏中Hippo信号,LKB1的肝脏特异性缺失会导致肝细胞增殖和肝肿大[8]。在肝脏角质形成细胞中,黏附连接蛋白α-Catenin通过与S127磷酸化的YAP和14-3-3形成细胞膜复合体来抑制YAP的活性,降低了YAP与蛋白磷酸酶2A21的可及性,抑制了肝细胞与细胞的黏连[9]。这表明细胞极性和黏附性复合体在调节肝脏中Hippo信号发挥重大作用。

2.2 生物力学调节 机械转导也被认为是Hippo-YAP信号的一个重要调节因子。在肝脏中YAP-TAZ通过纤维的形成和小GTP酶Rho的活性,在体外生长于高细胞外基质(ECM)上经历转录、核移位活性增加。一项荟萃研究表明,纤维在原代培养的小鼠肝细胞中触发YAP激活,使肝细胞功能丧失,从肝细胞中特异性地删除YAP 1,证明了机械转导在调节肝细胞YAP活性中的关键作用[10]。除此之外,Hippo信号还受其他信号调控,如细胞的氧化应激和代谢调节[11]。

3 Hippo信号通路YAP-TAZ下游调控

Hippo通路下游调控通过抑制转录共激活因子YAP/TAZ、Yki 影响细胞的基因型。有研究表明,YAP和TAZ调节Notch信号、抗凋亡途径、转化生长因子-β(转化生长因子β)信号、肌动蛋白聚合、Hedgehog信号、哺乳动物雷帕霉素复合体靶标1(MTORC 1)活性、核苷酸生物合成、AKT信号等共同影响肝脏,可通过调控下游抑制其转录活性起至关重要的作用[12,13]。

4 Hippo信号在肝脏再生中的信号传递

肝细胞和胆管细胞在肝脏损伤后,两者都会停止静止和增殖,以恢复肝脏,因此,肝脏具有极强的再生能力。研究发现,当严重肝损伤时,胆管细胞能够转分化为肝细胞[14,15]。而Hippo在肝脏再生中的信号传递已成为研究的热点。在急性肝损伤模型小鼠中表明,醋氨酚(APAP)过量会导致肝小叶坏死,后激发肝细胞的增殖,而在具有特异性高活性YAP信号的小鼠,可避免APAP诱导的肝损伤。这可能是由于将APAP代谢成其细胞毒性代谢物所需的基因表达减少所致,对APAP后MST1和MST2的药物抑制可减少肝细胞死亡[16]。一项荟萃研究发现,从肝细胞中缺失YAP1的小鼠表现出相同水平的肝损伤,但实验组中由于wnt-β-catenin诱导的肝细胞增殖更快,更有利于肝脏炎症反应的再生速度[17]。这表明Hippo信号通路在肝再生过程中具有动态功能。有学者研究发现,小鼠肝部分切除模型中,可诱导肝细胞增殖,直到肝脏恢复正常大小。早期通过肝细胞内磷酸化(非活性)YAP减少和核YAP定位增加,后MST1和MST2的药理抑制促进了小鼠肝部分切除后肝细胞的增殖和肝再生[18],而肝星状细胞(HSCs)中的YAP信号也可促进了肝部分切除后的肝再生[19]。一项实验评估YAP-TAZ在肝再生中的细胞类型特异性作用,小鼠急性肝损伤研究中,造成小叶中心肝细胞死亡,在接触CCl4肝细胞短时间显示出YAP-TAZ信号的强烈激活,缺失YAP1和WWTR1并不损害CCl4诱导的肝损伤后的肝再生,而删除YAP1和WWTR1在胆管细胞中胆汁淤积导致肝再生延迟,这表明肝脏能够激活替代途径来补偿特定信号途径的抑制[13]。

5 Hippo信号通路在肝癌中的作用

5.1 Hippo信号通路在肝细胞癌作用 肝细胞癌(HCC)在人HCC标本中发现有YAP的核聚积,YAP的激活与HCC亚型(Hippo途径基因、肝干细胞基因)相关,YAP1基因缺乏突变表明Hippo途径的抑制或在肿瘤发生过程中[20]。在肝癌中上游机制YAP的激活尚未完全明确。在小鼠中已证明胆汁酸超载可促进肝脏肿瘤的发生[21]。研究发现,肝脏肿瘤发生的驱动因素之一为糖原积累,糖原液滴可通过激活YAP促进肿瘤发生,多项肝细胞癌样本研究中,早期的恶性病变和小的肿瘤结节显示出高糖原含量,经过液液相分离的凝聚糖原示,MST1或MST2与糖原结合蛋白Laforin强烈结合,滞留在糖原小滴中,导致YAP在细胞系(HepG2细胞、小鼠肝细胞)中激活和核转位[22]。肝癌中致癌途径酪氨酸激酶受体与信号通路相互作用。YAP激活是通过EGFR信号在肝细胞癌中激活PI3K-PDK1诱导,YAP和EGFR抑制剂在肝癌细胞系可协同诱导细胞毒作用[23]。在肝癌患者肿瘤样本的分析发现,细胞外基质蛋白多糖集聚蛋白的基因表达增加,会激活YAP活性使肝癌细胞系的肿瘤发生[23]。有学者研究发现,在肝癌模型中癌基因诱导的小鼠表明,肿瘤基质细胞的激活过过Y AP-TAZ的高活性作用并降低了维替普芬对肿瘤的穿透,证明肝癌耐药的另一种机制是YAP依赖的药物转运受损[24]。已证实通过多种机制促进肿瘤的发生是YAP在肝细胞癌中转录活性的作用。Camargo等研究表明,NUAK2活性增加肌动蛋白张力及触发肌动蛋白聚合促进YAP活性,并且抑制减少了YAP驱动的肿瘤发生。此外,肝癌细胞侵袭、存活和迁移受激活Notch信号及TEAD4依赖的方式诱导JAG1的YAP活性发生[25]。

5.2 Hippo信号通路在肝母细胞瘤中作用 肝细胞癌中YAP和β-连环蛋白存在拮抗关系,在促进肝母细胞瘤方面有协同作用,在肝母细胞瘤细胞中,YAP-TAZ促进了氨基酸转运体核苷酸生物合成SLC38A1的表达,触发了下游mTORC1的激活和肿瘤发生[26]。一项荟萃研究表明,在肝母细胞瘤小鼠模型中,肿瘤细胞亚群中的凋亡驱动使YAP-S127A/成分活性的β-连环蛋白驱动导致肿瘤显著退化,而存活的肿瘤细胞中部分恢复了肝细胞分化功能,这提示靶向YAP治疗肝母细胞瘤可能是一种有效的治疗方法[27]。

5.3 Hippo信号通路在胆管细胞瘤中作用 YAP是胆管癌的致癌因素之一。YAP激活与胆管癌细胞侵袭、增殖、染色体不稳定性、血管生成及化疗耐药有关[28]。双重SB-HDTVI介导的NICD和AKT在胆管细胞中的表达导致快速胆管癌细胞的形成[29]。在胆管癌的NICD/Y AP-S127A小鼠模型中,YAP的下游靶点激活mTORC1,Rptor的缺失抑制了肿瘤的发展[30]。在YAP-AKT驱动的胆管癌细胞中,发现FGFR信号可上调胆管癌细胞中YAP的表达,抑制剂(PAN-FGFR)可降低肿瘤负担,因此,机械转导被认为是胆管癌发生的另一调节因素。实验中YAP-Y357促进胆管癌细胞中的核定位,是通过FAK直接磷酸化实现,致癌的FAK和AKT的过表达可导致胆管癌细胞的快速发展[31]。在胆管癌细胞中删除WWTR1和YAP1可显著降肿瘤负担,除了肿瘤细胞本身外,瘤周肝细胞特异性缺失会增加肿瘤负担,而在肝细胞癌和胆管细胞癌中亦有瘤周肝细胞中YAP的激活,从而降低了肿瘤负担[29]。

5.4 Hippo信号通路和癌症免疫力 Hippo信号通路在癌症免疫中扮演着新的角色。目前,癌症免疫治疗领域取得了较大的进展。如重新激活T细胞促进肿瘤细胞杀伤的抗PD1/PDL1治疗,复发(耐药)仍然是临床上待以解决的问题[32]。研究发现,YAP-TAZ具有抑制抗肿瘤免疫反应的作用,通过TAZ和YAP诱导人黑色素瘤、乳腺癌细胞株和肺癌中PDL1的表达,而PDL1的调控也因物种而异(在小鼠细胞系中不能复制)[33,34]。有研究发现YAP-TAZ在肿瘤细胞中的表达可促进获得性免疫抗癌反应,LAT S1和LAT S2的缺失在体外促进了肿瘤的生长,如将肿瘤细胞移植到具有免疫活性的同基因小鼠中,体内的肿瘤生长会受到抑制,此外,增强抗肿瘤免疫与LAT S1和LAT S2的缺失增加了富含核酸的细胞外小泡的产生,刺激I型干扰素反应密切相关[35]。在肝脏中炎症中YAP-TAZ的激活起促进作用。肝细胞中触发免疫细胞由YAP(Lats1/Lats2、Mst1/Mst2)激活的缺失。在小鼠中促进免疫逃避、巨噬细胞募集和肿瘤发生靠肝细胞致癌的YAP激活诱导CCL2表达相关[36]。相关研究发现,在小鼠NASH模型中,抑制肝细胞中上皮剪接调节蛋白2(ESRP2)的表达,由慢性炎症期间释放的促炎细胞因子所致,ESRP2负责Nf2成熟形式的剪接,ESRP2的缺失会导致YAP-TAZ149活性增加,表明其存在正反馈循环[37]。因此,YAP诱导的炎症在肿瘤进展中的作用有待考究。

另有研究对YAP活性的正调节因子的抑制剂、转录调节因子(溴域包含蛋4),这些抑制物缺乏对 Hippo信号通路的特异性[38]。研究发现,肝脏肿瘤发生过程中YAP的关键下游靶点是NUAK2,其药物抑制作用单独抑制了YAP驱动的活体肿瘤生长。有学者研究发现,针对特定类型的细胞抑制YAP-TAZ作用,可特异性对Hippo信号途径干扰RNA(SiRNA)而配制成靶向肝细胞的脂质纳米粒[38,39]。Mooring等[40]研究表明,肝细胞特异性的YAP-TAZ缺失通过肌纤维母细胞扩张及减少炎症来减少接触CCl4时的肝纤维化。

6 Hippo信号在慢性肝损伤中的信号传递

慢性肝损伤再生与YAP信号相关。慢性胆管炎共性为胆管反应,根据其损伤程度,胆管反应的细胞可能起源于肝细胞的去分化或胆管细胞的增殖,而Hippo信号正是此过程的关键调节因子,在胆管结扎胆管细胞模型小鼠中,Mx1-Cre缺失肝脏中的YAP 1会削弱BDL78后的胆管反应,增加YAP活性,减少肝细胞的增殖,从而肝细胞的坏死增加[41]。此外,胆管细胞及肝细胞中小鼠YAP 1的缺失,在4-二氢氯仿(DDC)、3,5-二乙氧基甲酰-1饲养中,胆管反应显著减少,由于CK19+细胞的增殖减少和凋亡增加作用[42,43]。此外,Li等[44]探讨肝细胞去分化是胆管反应细胞的主要来源研究发现,其编码依赖于ATP的SWI/SNF染色质重塑复合体的一个成分,YAP和ARID1a结合是由DDC诱导的HNF4SOX9+肝细胞中的基因发挥作用,在分离的ARID1A缺失的肝细胞中,靶部位与YAP结合靶基因的表达显著减少。可见促进YAP介导的转录在肝脏再生过程中ARID1A起着至关重要的作用。而在肝细胞中ARID1A和NF2特异性缺失,可激活YAP-TAZ转录活性、诱发肝脏过度生长,甚至肝癌[45]。

7 总结与展望

Hippo信号通路在肝脏中具有细胞类型特异性、复杂性、上下文特异性的作用,包括再生、发育及癌症的发生。虽然Hippo信号通路在干扰疾病方面的研究已经取得了进展,但有许多方面仍需要我们去探讨,例如YAP诱导的炎症在肿瘤进展中的作用等。在目前研究成果仍未能满足临床需求,开发抗YAP-TAZ治疗肝肿瘤的药物是一个新的研究方向。同时,调控Hippo信号避免促进肝脏再生的信号失活,可预防肿瘤的发生。此外,控制肝细胞向胆管细胞转化的关键转录或表观遗传机制是未来努力的方向。