张 婷 裴晓华 蔡 虹 吴剑华 徐振兴 王 敏,△

1.福建中医药大学第二临床医学院 (福建 福州, 350100) 2.北京中医药大学厦门医院

全球约有2.96亿乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者,死于HBV相关肝硬化、肝衰竭或肝癌等疾病的患者达82万人[1]。我国HBV相关肝硬化和肝细胞癌患者约占其总数的77%[2]和84%[2,3]。慢性乙型肝炎(CHB)是目前重要的传染性疾病,控制和切断HBV感染相关不良结局仍是研究的热点和难点。

HBV感染的恢复依赖于多细胞介导的免疫应答[4,5],尤其是CHB患者辅助性T淋巴细胞(Th)和细胞因子的异常与CHB抗病毒疗效密切相关[5,7]。本课题组前期临床研究结果证实了复方栀子根颗粒治疗CHB的临床疗效[8,9],本次研究在此基础上,采用复方栀子根颗粒联合TDF治疗肝胆湿热型CHB患者,致力于研究对CHB患者血清细胞因子的影响,探索中药复方作用靶点。

1 资料及方法

1.1 一般资料 纳入2020年1月至2022年6月就诊于厦门市中医院住院及门诊的初治CHB患者80例,按照1∶1的比例随机分组,去除脱落、剔除病例共5例,最终有75例(治疗组35例,对照组40例)完成临床观察并纳入分析。本研究已获得厦门市中医院伦理委员会批准(批准号: 2019-K014-01)。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准[10]兼备①②③或①②④项者可诊断为CHB:①血清HBsAg持续阳性>6个月;②血清HBV DNA阳性;③近3个月血清ALT反复升高(大于正常值上限);④若肝功能正常,则肝穿刺活检证实为慢性肝炎且纤维化程度分期S≥2或G≥2。

1.2.2 中医辨证标准[11](1)具备所有主症(2+0);(2)具备主症①及3项次症中的任意2项(①+2);(3)兼具主症②及次症①、②(②+①②)。满足(1)(2)(3)中1项即可诊断为肝胆湿热证。主症:①胁肋胀痛;②舌苔黄腻;次症:①纳呆呕恶,厌油腻;②尿黄;③身目发黄。

1.3 纳入及排除标准 纳入标准:①符合诊断标准者;②未抗HBV治疗、未服用其他保肝药,具有抗病毒治疗指征;③排除合并其他可能导致肝功能异常原因;④患者知情并签署知情同意书。排除标准:①合并其他肝炎病毒、HIV、梅毒、肝硬化、肝癌及其他慢性肝病者;②合并呼吸、循环及其他系统严重原发病者;④近12周有参加其他实验者;⑤妊娠及哺乳期妇女;⑥不同意进入该临床研究者;⑦依从性差者。

1.4 治疗方案 对照组患者予口服富马酸替诺福韦二吡呋酯(300 mg/片,成都倍特药业,国药准字H20163436),1次/日,1片/次,观察24周后继续服用。治疗组在此基础上加用复方栀子根颗粒(中药免煎剂),组成:茵陈、栀子根各30 g, 黄芪、佛手、鳖甲、丹参、太子参、龟板、败酱草、郁金、延胡索各12 g,茜草、丹皮、柴胡各6 g,三七3 g;规格:每包15 g。冲服,每日2次,每次1包,治疗24周。

1.5 观察指标

1.5.1 中医症状评分标准[12]治疗前后观察到的患者症状、体征分为正常及轻、中、重度异常4个级别,计分方式按其严重程度,计主症:0、3、6、9分,次症:0、2、4、6分,计各项评分之和为最终中医症状积分。见表1。

表1 主、次症分级量化表

1.5.2 实验室指标 分别于治疗前及治疗4周、24周采集2组患者清晨空腹静脉血,采用速率法运用美国贝克曼AU5800全自动生化分析仪检测血清ALT(正常值7～40 U/L)、AST(正常值13～35 U/L)、GGT(正常值7～45 U/L)水平。HBV DNA定量采用荧光PCR法经ANADAS9850全自动核酸提纯及荧光PCR分析系统(试剂盒购自厦门安普利公司,定量下限为20 IU/ml);血清HBsAg、HBeAg定量采用磁微粒化学发光法经AutoLumo全自动化学发光测定仪检测(试剂盒购自郑州安图公司,定量下限为0.05 IU/ml、0.1 IU/ml);血清IL-23、IL-17、IL-10、IL-6水平采用96孔ELISA试剂盒(购自南京森贝伽公司)检测。

1.5.3 安全性观察 常规检查:治疗前后血、尿、大便常规,尿NAG,肾功能,采用全自动生化仪。物理检查:治疗前后心电图。

1.6 临床证候疗效评定标准[12]临床痊愈:患者主要症状及体征消失或基本消失,疗效指数≥95%;显效:主要症状及体征明显改善,疗效指数为70%～94%;有效:主要症状、体征改善,疗效指数为30%～69%;无效:主要症状及体征无明显改善甚或加重,疗效指数<30%。备注:疗效指数(%)=[(治疗前证候积分-治疗后证候积分)/治疗前证候积分]×100%(尼莫地平法)。总有效率=(总有效例数/总例数)×100%。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件对数据进行统计分析。计量资料不符合正态分布者,采用中位数(四分位数间距)表示,计数资料以例(%)表示。计量资料组间比较均采用Wilcoxon Mann-WhitneyU检验,治疗前后比较采用Wilcoxon符号秩和检验;无序分类变量的2×C表采用Pearson χ2或Fisher′s确切概率法进行检验。P<0.05,表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例流程 本研究共纳入肝胆湿热型初治CHB患者80例进入临床观察,按照随机数字表以1∶1随机分为2组,观察期间受疫情影响产生2例失访脱落病例,因患者个人原因脱落1例,因未按疗程用药剔除2例,最终共75例纳入分析(治疗组35例,对照组40例)。见图 1。

图1 病例流程

2.2 两组患者治疗前后肝功能变化 见表2。

表2 肝功能(ALT、AST、GGT)变化比较 M(IQR)

2.3 两组患者治疗前后病毒学指标变化 见表3。

表3 血清病毒学指标(HBV DNA、HBsAg、HBeAg)变化比较 M(IQR)

2.4 两组患者治疗前后血清细胞因子变化 见表4。

表4 血清细胞因子(IL-6、IL-10、IL-17、IL-23)变化比较 M(IQR)

2.5 两组患者临床证候疗效评定 见表5。

表5 临床证候疗效比较 [例(%)]

2.6 两组患者不良反应比较 见表6。

表6 不良反应比较 [例(%)]

2.7 两组患者基线资料比较 治疗前两组年龄、性别、肝脏炎症及纤维化程度、肝功能、血清病毒学指标差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。见表7。

表7 基线资料比较 M(IQR)/例(%)

3 讨论

中药复方联合TDF治疗CHB在改善患者临床症状、减轻肝脏炎症和纤维化具有较好的临床优势[13,14]。 复方栀子根颗粒是康良石教授在长期临床实践中总结出的有效方剂基础上研制的院内制剂,已用于治疗CHB 20余年,其以清热利湿、软坚散结立法,方中栀子根、鳖甲为君药,以清热利湿、软坚散结,配伍茵陈为臣,对于肝胆湿热型CHB患者更具治疗优势。我们课题组前期研究结果显示:复方栀子跟颗粒可显著的阻断和防治CHB所致肝纤维化[8,9,15]。本次研究结果表明复方栀子根颗粒联合TDF治疗CHB患者24周转氨酶水平、HBsAg定量、HBV DNA较治疗前均下降,与单药治疗前后无统计学差异,提示中药复方联合组和西医单药组降低转氨酶、HBsAg定量、HBV DNA定量作用相似,与前期复方栀子根颗粒联合TDF治疗CHB患者48周,联合组对HBsAg阴转率优于西医单药组的研究结果不一致[9]。究其原因为本次研究受疫情影响,整体服用中药疗程(24周)较之前(48周)短,影响疗效。但本次研究发现,中药复方联合组患者治疗4周时,降低转氨酶的效果优于同期单用西药组,提示联合治疗可更快改善肝功能,并且临床总有效率高于对照组,不良反应少,在临床上确有减毒增效之效。

慢性HBV感染中,HBV清除或持续性感染与机体免疫反应密切相关,且各类细胞因子的相互共同作用与T细胞的细胞效应密切相关。促炎因子IL-17主要来源于Th17细胞,IL-23是促进Th17增殖、分化及维持其功能的重要因子,Mandy J McGeachy等在敲除小鼠IL-23受体后观察到CD4+T细胞明显下降,并在体外实验中观察到CD4+T细胞源性IL-17同样显著降低,但加入IL-23后IL-17的分泌显著增加[16,17]。一项纳入67名初治CHB患者的研究,通过采集这些患者的肝组织样本构建体外实验,表明抑制IL-10能够显著升高CD4+T细胞频率,降低Breg细胞对CD4+T细胞的抑制,从而调节HBV特异性T细胞的抗病毒能力[18]。IL-6一直被认为是促进Tfh细胞生成的主要细胞因子。敲除IL-6受体后,慢性病毒感染小鼠中的病毒特异性和多克隆激活性CD4+T细胞显著减少,Th1和Tfh样应答功能受损,且病毒特异性CD8+T细胞耗竭加剧[19,20]。

部分细胞因子水平也与肝病不良结局相关。相较健康人群,CHB患者血清中IL-6水平更高,而显著升高的IL-6可促进HCC的进展[21-24]。血清中异常分泌的IL-17可促进炎症反应,从而加重肝硬化及肝纤维化,异常升高的IL-10与HBV DNA载量及肝脏炎症密切相关,可能是导致HBV促进肝纤维化的重要原因之一[21]。在CHB相关肝肿瘤进程中,IL-23促进巨噬细胞分泌VEGF,通过多通路参与HCC的增殖和转移,且对HBeAg清除和HBsAg下降具有预测价值[25]。

两组治疗后血清IL-6、IL-10、IL-17、IL-23水平均较治疗前下降,治疗后治疗组IL-6、IL-23水平较对照组下降更显著,提示中药复方联合治疗可进一步降低炎症细胞因子水平,从而调节机体免疫,改善远期预后。目前的药理研究证实复方栀子根颗粒中的某些中药成分如黄芪、丹参等可以促进机体IL-6、IL-23水平的下调[26-29]。其中IL-6作为一种多效性因子,在肝细胞的生物反应中发挥促炎作用,IL-23是Th17在HBV慢性感染过程中发挥免疫功能的重要效应分子[30],最近发现Th17细胞与宿主防御和自身免疫相关[31]。因此推断复方栀子根颗粒是否通过其它途径调节宿主免疫,进而影响T细胞分泌细胞因子水平,同时细胞因子的水平变化又影响T细胞功能,符合中药复方的多途径、多靶点作用特点。

本次研究初步证实了复方栀子跟颗粒联合TDF,较单用西药治疗能更快改善患者肝功能水平、减轻临床症状、影响细胞因子水平,因此可能降低了HBV相关肝硬化、肝癌不良结局风险。同时从患者血清细胞因子角度,探讨了复方栀子根颗粒作用机制,为下一步研究该药实现CHB免疫控制奠定基础。但同时也存在几个局限:①样本量相对较小,所检细胞因子种类有限;②受疫情影响,中药复方疗程较短,限制了其临床疗效;③抗乙肝病毒药物治疗CHB期间细胞因子水平变化是否与血清HBV DNA转阴、HBsAg定量降低存在关系,仍需临床进一步研究。