喻秋菊,侯 杰,林钰灵,罗 佳,谢 轶,马 莹

四川大学华西医院实验医学科,四川成都 610041

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一类慢性传染病。据世界卫生组织(WHO) 2022年全球结核病报告显示,结核病全球疾病负担高,MTB耐药常见,中国位居耐药结核病高负担国家前列[1]。抗结核药物敏感性检测对于制订患者的个体化治疗方案、地区耐药监测等至关重要。传统的表型药物敏感试验(DST)耗时长,往往无法常规开展;快速靶向分子检测方法能明显缩短时间,目前被广泛运用于临床,但其检测耐药突变位点有限。全基因组测序(WGS)克服了传统的表型DST及快速靶向分子检测的局限性,具有快速、高通量、准确度高、能够检测所有已知的耐药相关突变位点等优点,且伴随测序成本的降低,其在临床MTB耐药检测中的应用日益广泛。本研究通过DST和WGS,检测四川大学华西医院共71例MTB临床分离株对14种药物耐药情况,分析耐药基因突变类型和特点,并探讨两种方法的一致性,以便能够为结核分枝杆菌感染检测和治疗提供科学依据,对结核病的防控和治疗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1菌株来源 2018—2020年留存于四川大学华西医院实验医学科共71株MTB临床分离株。所有菌株分离自临床标本MGIT 960液体培养阳性培养物,且分枝杆菌萋-尼抗酸染色镜检阳性,结核分枝杆菌特异性抗原MPT64检测阳性(排除非结核分枝杆菌)。

1.2仪器与试剂 主要仪器:BACTECTM MGIT 960(美国BD公司)。主要试剂:罗氏培养管(珠海贝索生物技术有限公司);结核分枝杆菌抗原MPT64检测试剂盒(标准诊断韩国股份有限公司);结核分枝杆菌药敏试剂盒(中国郑州安图生物工程股份有限公司)。

1.3研究方法

1.3.1菌株复苏培养 将含有MTB临床分离株菌液的冻存管放入37 ℃恒温培养箱中复苏,使用无菌滴管混匀菌液,吸取0.3 mL菌液接种至罗氏培养基上,37 ℃恒温培养箱中培养2～3周,获得纯化菌落。

1.3.2DST 本研究菌株使用氧化还原指示剂(CRI)法严格按照安图生物技术公司结核分枝杆菌药敏试剂盒说明书操作,CRI是WHO推荐的检测结核分枝杆菌药敏的方法[2],主要通过氧化还原指示剂颜色变化显示结核分枝杆菌是否生长。操作如下。制备麦氏标准1号管浊度的菌悬液,吸取1麦氏菌悬液0.2 mL,添加到1瓶培养液中,充分混匀;用无菌吸管吸取0.5 mL添加有菌悬液的培养液至药敏板各个板孔中,盖上盖子,将药敏板放入透明自封袋中密封,35～37 ℃培养;培养6 d后,每日观察质控孔,质控孔出现白色颗粒沉淀后,每孔分别添加显色剂A 12 μL、显色剂B 25 μL,35～37 ℃培养,24～48 h后判读结果。14种抗结核药物分别是异烟肼(INH)、利福平(RIF)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、莫西沙星(MFX)、氧氟沙星(OFX)、左氧氟沙星(LFX)、阿米卡星(AMK)、卡那霉素(KAN)、卷曲霉素(CPM)、利福布汀(RFB)、乙硫异烟胺(ETH)、对氨基水杨酸(PAS)、氯法齐明(CLO)。

1.3.3WGS 用一次性无菌接种环挑取上述复苏培养后的纯化菌落黄豆粒大小至TE溶液中,金属浴80 ℃灭活30 min。灭活后的样品干冰邮寄至上海晶诺生物科技有限公司,在Illumina平台上构建文库进行测序,测序完成后返回测序原始数据。

1.3.4WGS数据质控 获得的测序原始数据用Trimmomatic(v0.39)软件去除原始数据中的接头序列并过滤掉碱基质量<20的低质量reads[3];用FastQC(v0.20.0)对上述Trimmomatic,处理过的数据进行质控,得到clean data用于后续分析[4]。

1.3.5WGS耐药预测 用TBProfiler(https://github.com/jodyphelan/tbdb)对14种抗结核药物进行耐药预测[5-6]。为了最大程度地覆盖可能的耐药基因,除了TBProfiler所参考的tbdb结核分枝杆菌耐药数据库外,分析讨论中结合相关研究补充了其他药物相关耐药基因:INH(nat、ndh、inia、inib、inic、Rv0340、efpA、furA、fadE24、Rv1592c、Rv1772和fabD)、CPM(Rv0194、Rv1258c)、PAS(papA1、sigB、Rv1258c、mmpL11、Rv0044c、Rv0954和nuoL),但因为这些基因与MTB药敏表型耐药尚存在争议,有待进一步研究,因此上述基因突变暂不作为判断药物敏感性的标准[7-10]。用Snippy(v4.6.0)以MTB标准菌株H37Rv(GenBank ID:NC_000962.3)为参考基因组进行比对,提取SNP序列[11];用Blast工具将SNP序列同标准菌株比对,检测耐药相关基因序列内的突变位点。于NCBI网站比对突变位点所在的读码框,明确突变类型,以是否发生耐药相关突变作为判断药物敏感性的标准。除非特别说明,本研究所用的生物信息学软件一般都采用默认参数设置。

1.4统计学处理 采用R(4.2.3版本)软件对数据进行统计学分析。通过Kappa检验分析两种方法一致性(Kappa≥0.75二者一致性较好;0.75>Kappa≥0.40二者一致性一般;Kappa<0.40二者一致性较差)。

2 结 果

2.1MTB临床分离株表型DST和WGS耐药预测结果 两种方法分别检测71株MTB临床分离株对14种药物的耐药情况,结果见表1。

表1 71株MTB表型DST和WGS耐药情况

2.2两种耐药检测方式一致性对比 对DST和WGS两种方法进行一致性分析Kappa检验,结果显示,一线抗结核药物RIF、RFB和SM,二线抗结核药物氟喹诺酮类MFX、OFX和LFX,以及氨基糖苷类药物AMK,这7种药物耐药一致性检测最好,符合率均超过90.00%,Kappa值均>0.80;一线抗结核药物INH和EMB符合率均超过80%,但Kappa值分别为0.68和0.54,一致性一般。KAN、ETH、CPM、CLO和PAS这5种药物一致性均较差。见表2。

表2 DST和WGS检测一致性分析

2.3DST表型耐药和同时WGS发生基因突变的临床分离株有关基因突变类型分析 将DST检测得到的表型耐药株和同时经WGS检测发生基因突变的菌株数据相结合,结果显示,INH耐药株最常见的突变类型为 katG S315T,有1株发生katG T394A+ inhA S94A+ fabG1 -15C>T联合突变。RIF和RFB最常见的突变类型均为 rpoB S450L,其次为rpoB L452P。EMB耐药株主要与embB基因不同位点发生突变有关,主要为306和406。SM 耐药株主要突变类型为 rpsL K43R和rrs 514A>C。喹诺酮类药物MFX、OFX和LFX耐药株主要发生gryA D94G、D94N和A90V基因突变。氨基糖苷类药物AMK、KAN和CPM突变类型较单一,为rrs 1401A>G突变。ETH耐药株有2株,分别是inhA联合fabG1基因突变和ethA基因突变。PAS耐药株仅1株发生folC基因突变;CLO未检出相关耐药基因。见表3。表3中仅列出至少有2株的药物突变类型数量,因为氨基糖苷类AMK、KAN和CPM,CLO、ETH、PAS耐药株少,突变类型单一且无主要突变类型故未列出。

表3 MTB表型耐药株基因突变类型

3 讨 论

结核分枝杆菌表型DST方法可检测多种抗结核药物的耐药性且不受耐药机制限制,如比例法,MIC检测等,但表型DST方法也有较多局限性,如MTB培养周期长,接近临界值时难以判读等[12]。随着MTB耐药分子机制的阐明,实时荧光定量PCR、探针熔解曲线法、基因芯片技术等靶向分子检测方法通过基因扩增可以快速而敏感地从分离株或预处理的临床标本检测MTB相关耐药基因型或常见耐药决定区域,但目前商业化试剂并未涵盖所有的耐药突变位点,可能出现假阴性[12-15]。WGS可以完整地描述MTB耐药株的基因组特征,广泛涵盖多种抗结核药物的基因突变位点,在MTB耐药性检测、谱系或亚种鉴定(菌株分型)、微进化及结核病流行病学等方面的研究越来越广泛[16]。本研究通过表型DST和WGS同时检测MTB临床分离株14种抗结核药物的耐药性,评估WGS用于MTB耐药性检测与表型DST的一致性,分析WGS对不同抗结核药物耐药性检测的优缺点。

RIF、RFB和利福喷丁(RFT)均为一线抗结核药物,其作用靶标DNA依赖性RNA聚合酶(RNAP)β亚单位编码基因rpoB突变可能导致MTB对其耐药,三者具有70%～90%的交叉耐药率[17]。本研究中RIF、RFB两种耐药性检测方法符合率>95%,一致性良好,与已有研究结果类似[18-19]。本研究利福霉素类主要突变类型为rpoB S450L和rpoB L452P。

INH、ETH属于结构类似物,经各自的酶激活后,作用共同靶点inhA,若MTB有inhA基因突变,则二者可能存在交叉耐药[20-21]。本研究结果显示,INH符合率超过80%,一致性一般,ETH一致性较差,这可能与其复杂的分子作用和耐药机制有关。INH涉及katG、inhA、ahpC、kasA、ndh、iniABC、fadE、furA、Rv1592c和Rv1772等多个基因的突变及表达改变,ETH 涉及ethA、inhA、ethR、fabG1等基因[21-23]。本研究中DST和WGS检测INH耐药性结果不一致菌株有11株(15.49%,11/71),其中有9例INH表型耐药株未发现INH常见基因(katG、inhA、ahpC、fabG1)。而进一步分析INH(nat、ndh、inia、inib、inic、Rv0340、efpA、furA、fadE24、Rv1592c、Rv1772和fabD)相关耐药基因[7],结果显示,共71例MTB临床分离株中,只有在上述9株表型耐药株中有1株存在ndh P315L,1株存在nat G207R,1株存在inib S265G,1株在inib基因碱基657位和658位之间插入一段GTTGGCGCTGGT共12 bp长的序列,提示这4种突变可能与INH耐药相关。

乙胺丁醇耐药机制比较复杂,与embCAB操纵子、embR、ubiA等基因突变有关,且以embB突变为主[24-25]。对于EMB,EMB耐药一致性一般主要也是因为DST和WGS结果不一致菌株较多,共有13株(18.31%,13/71),其中有8株表型敏感但检出6种突变位点,分别是embB M306I、M306V、G406A、G497R、A659T+A388G+L359I+H312R+N399位点联合和embA -16C>G。有研究报道,embB M306I、M306V、G406A、Q497R在EMB表型耐药和敏感中均有存在[26-27]。有研究表明,embB M306I存在突变的分离株的MIC接近或轻微大于EMB耐药的界定浓度,即embB M306I有时还并不足以判断药物表型耐药[28]。因此也推测另外5种位点突变的原因可能与embB M306I类似。另外,在5例表型耐药株中有1例检出embA G1085V突变,可能是一种新的embA耐药相关突变位点。

氟喹诺酮类药物MFX、OFX、LFX是治疗耐多药结核病的重要药物,靶点是Ⅱ型DNA拓扑异构酶,其耐药机制主要涉及gyrA、gyrB基因突变[29]。本研究中MFX、OFX、LFX耐药率在20.00%～25.00%,两种耐药性检测方法符合率>95.00%,一致性良好,BERNARD等[30]研究也显示gyrA、gyrB联合测序显示了表型DST方法检测氟喹诺酮类的局限性。氟喹诺酮类药物主要突变类型为gyrA D94G、gyrA D94N、gyrA A90V,氨基酸最常见替代位置为D94,与先前研究一致[30-31]。

本研究中氨基糖苷类药物中耐药率明显存在差别,SM耐药率>20.00%,而KAN、AMK耐药率不足3.00%,先前的研究也同样发现这种差异[32]。两种方法检测SM耐药性的符合率为94.00%,一致性良好,WGS具有较大临床应用潜力。由于AMK 和KAN耐药菌株数量少,虽然两种检测方法符合率>95.00%,但本研究结果仅供参考,其耐药机制与rrs(Rvnr01)、eis(Rv2416c)和whiB7等基因突变有关[33]。值得注意的是,本研究CPM耐药检测一致性极差,主要是因为共有27例CPM 表型耐药,只有1株发生rrs 1401A>G基因突变。有研究显示,氨基糖苷类药物SM和CPM的耐药机制相似,导致两种药物之间存在有交叉耐药的可能[34-35]。MTB对SM耐药主要由rpsL(编码核糖体蛋白S12)、rrs(编码16S核糖体RNA)和gidB(编码7-甲基鸟苷甲基转移酶)等基因突变引起[36]。DST有27例CPM表型耐药株中有3株存在rrs 514A>C,同时SM表型耐药;4株存在rpsL K43R,同时SM表型耐药;1株存在gid第351位碱基G缺失,但SM表型敏感。CPM与SM存在交叉耐药,可能部分解释WGS检测CPM耐药性与DST一致性差的原因,但这差异也可能与其他耐药机制有关。因此,需要进一步明确地阐述CPM耐药机制,以及其与SM交叉耐药共同关联的基因突变类型,可能有助于提升WGS检测CPM耐药的能力。

此外CLO、PAS和ETH 3种药物一致性均较差主要都是因为表型耐药但未检测到耐药相关基因突变株数相对较多,CLO有9株,但其中9株CLO中有1株发生Rv1979c V426I基因突变,Rv1979c与CLO耐药相关[37]。但以往研究中未发现V426I位点突变,因此值得进一步研究。PAS有5株,ETH有15株。这3种药物一致性差不能从基因突变层面解释,说明很有可能存在其他的耐药机制,当然,也可能受到检测方法的影响,比如这3种药物的DST重复性差。

综上所述,与传统的表型DST方法相比,WGS 耗时更短,WGS对不同抗结核药物耐药性的检测能力有所差异,其对RIF、RFB、SM、MFX、OFX和LFX 6种药物耐药性检测较佳,而检测其他抗结核药物耐药性仍存在一定缺陷,需要进一步明确相关药物的详细耐药机制,并对WGS用于耐药性分析的标准化进行探索。