曾 艳,冯 丹,倪俊晓,杨 梅

凉山彝族自治州第二人民医院:1.妇科; 2.病理科,四川凉山 615000

子宫内膜癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,发病率仅次于宫颈癌,且近年来发病率与病死率呈上升趋势[1-3]。子宫内膜癌患者初期会出现阴道出血、阵发性腹部疼痛等症状[4],遗传、肥胖、雌激素长期且持续的刺激均与子宫内膜癌的发生有关[5]。长链非编码RNA(LncRNA)是一种长度在200 nt以上的RNA分子,广泛存在于各组织、器官中,LncRNA可通过调控表观遗传基因、转录和翻译等过程参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等过程[6]。相关研究表明,lncRNA HOXA-AS2在多种恶性肿瘤中异常表达,与恶性肿瘤的发生与进展有关[7]。lncRNA FOXD2-AS1与lncRNA CRNDE也分别与骨肉瘤细胞、口腔鳞癌、膀胱癌等癌细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关[8-10]。基于此,本研究分析子宫内膜癌患者的癌组织中HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE的表达与患者临床病理特征、预后的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年10月至2020年2月于本院住院手术的119例子宫内膜癌患者作为研究组。纳入标准:(1)患者均行宫腔镜刮宫取材,经病理检查符合子宫内膜癌的诊断标准,确诊为子宫内膜癌[11];(2)患者临床资料及随访资料完整;(3)患者及家属签署知情同意书。排除标准:(1)合并其他恶性肿瘤;(2)有其他手术或药物治疗史;(3)合并心、肝、肾等脏器功能不全;(4)合并免疫系统疾病;(5)合并急慢性感染。收集术中切除子宫内膜癌患者的癌组织标本及癌旁组织标本,并收集整理子宫内膜癌患者的年龄、体重指数(BMI)、肿瘤最大径、国际妇产科学联合会(FIGO)分期、淋巴结转移、浸润深度、分化程度、病理类型等临床资料。年龄40～65岁,平均(55.14±5.71)岁,平均BMI(23.79±3.66)kg/m2,均根据患者病情及自身身体状况进行了放疗、化疗、激素治疗等治疗。研究组临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会审批后严格按照规定程序执行。

1.2仪器与试剂 7300型实时荧光定量PCR仪购于美国ABI公司。Trizol试剂购于上海文韧生物科技有限公司;PrimeScript miRNA cDNA Synthesis反转录试剂盒购于日本TaKaRa公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒购于Takara公司;SYBR Green Master Mix(2×)购于北京伊塔生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1子宫内膜癌患者癌组织及癌旁组织中HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE表达水平测定 所有患者均行根治性/改良根治子宫切除术加双侧输卵管和卵巢切除手术,术中收集子宫内膜癌患者癌组织和癌旁组织,癌组织取自病变处,癌旁组织取自癌组织远端3 cm以外处正常组织。将所取组织投入液氮中保存,之后迅速转移至—80 ℃冰箱保存待测。按照Trizol试剂操作步骤分离提取组织总RNA,并测定其浓度和纯度。采用PrimeScript miRNA cDNA Synthesis反转录试剂盒以RNA为模板逆转录为cDNA,按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明进行PCR扩增。PCR反应体系共20.0 μL:cDNA(50.0 ng/μL)2.0 μL,SYBR Green Master Mix(2×)10.0 μL,PCR上下游引物(10.0 μmol/L)各0.5 μL,加ddH2O至20.0 μL,PCR反应条件为95 ℃、1 min变性,95 ℃、15 s,60 ℃退火1 min,40个循环,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,进行数据分析,使用2-ΔΔCt方法计算HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.2随访 以电话及门诊复查的方式对纳入研究的子宫内膜癌患者进行为期3年的随访(随访截止至2023年2月),每2个月随访1次,记录患者的生存状况,当患者出现癌因死亡时则随访结束。

2 结 果

2.1子宫内膜癌患者癌组织及癌旁组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE相对表达水平比较 子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE相对表达水平均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 子宫内膜癌患者癌组织及癌旁组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE相对表达水平比较

2.2子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1和CRNDE相对表达水平的相关性分析 子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE相对表达水平两两之间均呈正相关(rHOXA-AS2 vs. FOXD2-AS1=0.384,P=0.001;rHOXA-AS2 vs. CRNDE=0.576,P<0.001;rFOXD2-AS1 vs. CRNDE=0.326,P=0.003)。

2.3子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE相对表达水平与临床病理特征的关系 以子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE相对表达水平的中位数为临界值,将患者分为HOXA-AS2高表达组、HOXA-AS2低表达组,FOXD2-AS1高表达组、FOXD2-AS1低表达组,CRNDE高表达组、CRNDE低表达组,分析子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE相对表达水平与临床病理特征的关系,结果显示,不同年龄、BMI、肿瘤最大径、病理类型的子宫内膜癌患者HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE相对表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE高表达组中FIGO分期为Ⅲ+Ⅳ期、发生淋巴结转移、浸润深度为深层、分化程度为低分化的患者所占比例高于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE表达与患者预后的关系 采用Kaplan-Meier法分析子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE表达与患者预后的关系,结果显示,子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2低表达组3年生存率(52/60,86.67%)高于子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2高表达组(40/59,67.79%),差异有统计学意义(χ2=6.039,P<0.05);子宫内膜癌患者癌组织FOXD2-AS1低表达组3年生存率(53/59,89.83%)高于子宫内膜癌患者癌组织FOXD2-AS1高表达组(39/60,65.00%),差异有统计学意义(χ2=10.456,P<0.05);子宫内膜癌患者癌组织CRNDE低表达组3年生存率(51/60,85.00%)高于子宫内膜癌患者癌组织CRNDE高表达组(41/59,69.49%),差异有统计学意义(χ2=4.079,P<0.05)。见图1～3。

图1 子宫内膜癌患者癌组织HOXA-AS2表达与患者预后的关系

图2 子宫内膜癌患者癌组织FOXD2-AS1表达与患者预后的关系

图3 子宫内膜癌患者癌组织CRNDE表达与患者预后的关系

2.5多因素Cox回归分析影响子宫内膜癌患者预后的相关因素 以子宫内膜癌患者3年内是否死亡为因变量(是=1,否=0),以癌组织HOXA-AS2(高表达=1,低表达=0)、癌组织FOXD2-AS1(高表达=1,低表达=0)、癌组织CRNDE(高表达=1,低表达=0)为自变量进行多因素Cox回归分析,结果显示,癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE是子宫内膜癌患者死亡的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 多因素Cox回归分析子宫内膜癌影响患者预后的相关因素

3 讨 论

子宫内膜癌是发于子宫内膜上皮的恶性肿瘤疾病,据流行病学调查结果显示,其发病率约占女性所有恶性肿瘤的8%,绝经后妇女是子宫内膜癌的高发人群[12]。目前常采用子宫内膜活检配合影像学检查对其进行诊断,但此操作过程常对患者造成创伤及痛苦[13],因此寻找简单、便捷且具有较高准确性的诊断指标具有重要意义。血清肿瘤标志物检测由于具有创伤小、操作简便、花费低等优势,成为了近年来的研究热点,常将其用于恶性肿瘤的早期诊断及预后评估[14]。基于此,本研究主要测定子宫内膜癌的癌组织中HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE相对表达水平,分析三者与子宫内膜癌患者临床病理特征及预后的关系。HOXA-AS2在胃癌、胰腺癌、乳腺癌等癌组织中均呈现异常表达。谢德玲等[15]报道,下调HOXA-AS2能起到抑制卵巢癌细胞增殖、迁移的作用。本研究中,子宫内膜癌的癌组织中HOXA-AS2表达水平高于癌旁组织。陈升阳等[16]研究结果显示,在胰腺癌组织中HOXA-AS2相对表达水平高于癌旁组织,这与本研究结果一致。有学者推测HOXA-AS2主要是通过调控信号轴或通路来影响恶性肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭过程,进而影响恶性肿瘤疾病的发生、发展及患者的预后状态[17-18],此结果提示HOXA-AS2相对表达水平的升高能够促进子宫内膜癌的发生,可能能够作为预测子宫内膜癌患者预后状态的特异性指标。FOXD2-AS1和CRNDE也与癌症的发生、发展密切相关[19-20],本研究结果显示,子宫内膜癌的癌组织FOXD2-AS1和CRNDE相对表达水平均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。李敏等[21]研究发现,宫颈癌组织FOXD2-AS1表达水平较正常组织升高,高峰[22]发现,CRNDE与胰腺癌细胞的增殖、迁移有关,这些报道结果均与本研究结果一致。结合相关性分析结果来看,HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE三者均对子宫内膜癌的发生起到促进作用。这可能是由于lncRNA HOXA-AS2、FOXD2-AS1及CRNDE能够通过调控细胞的生长周期,对基因的转录起到促进或抑制的作用,同时还能够介导染色质间的相互作用,对表观遗传进行修饰,进而达到影响肿瘤细胞增殖、侵袭及转移的目的,并且LncRNAs的异常表达还能够影响机体的肿瘤免疫及耐药性,进而对治疗效果及患者的预后状态产生影响[23]。本研究进一步分析HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE表达与子宫内膜癌患者临床病理特征的关系,结果显示HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE高表达组中FIGO分期为Ⅲ+Ⅳ期、发生淋巴结转移、浸润深度为深层、低分化的患者所占比例高于低表达组,这表明HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE不仅与子宫内膜癌的发生有关,还能够通过促使淋巴结转移、浸润深度增加等,促进子宫内膜癌发展。最后采用Kaplan-Meier法分析子宫内膜癌的癌组织HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE表达与患者预后的关系,结果显示HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE低表达患者3年生存率均高于高表达患者,并且HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE是影响子宫内膜癌患者死亡的危险因素,提示临床检测子宫内膜癌的癌组织中HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE表达水平,对患者预后具有重要意义。但是由于本研究取样范围较为单一,样本量较少,结果可能存在一定偏倚,而且仅对子宫内膜癌的癌组织及癌旁组织中HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE进行了定量分析,未进行免疫组化染色及图像观察,后续会继续增加样本量进行深入探究,进一步验证本研究结果。本研究结果显示,子宫内膜癌的癌组织中HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE的表达与患者临床病理特征及预后密切相关。然而,本研究纳入的样本量较少,后续仍需增加样本量对本研究结果进行验证,且HOXA-AS2、FOXD2-AS1、CRNDE参与子宫内膜癌发生发展的具体机制仍需进一步探究。